【摘要】：縫隙連接(OJ)介導相鄰細胞間的物質(zhì)交換和信息交流,在調(diào)控細胞生長、增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡的穩(wěn)態(tài)平衡中起著重要作用。鎘是一種重要的工業(yè)和環(huán)境污染物,可誘導多種細胞凋亡。為探討鎘對大鼠肝細胞(BRL 3A)縫隙連接通訊功能的影響及縫隙連接在鎘致BRL 3A細胞凋亡中的作用,本實驗以不同濃度的醋酸鎘(0、2.5、10 μmol/L)作用BRL 3A細胞12 h或10 μmol/L醋酸鎘、5 μmol/L 18β-甘草次酸(18 P-glycyrrhizic acid, GA)單獨或聯(lián)合作用細胞9 h,采用實時分析技術(RTCA)測定細胞指數(shù)(CI),顯微鏡觀察細胞形態(tài),劃痕染料標記示蹤法(SL/DT)檢測細胞縫隙連接通訊(GJIC),激光共聚焦觀察縫隙連接蛋白Cx43分布,hoechst 33258染核,流式細胞術測定胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+],)和細胞凋亡率,免疫印跡測定Cx32、Cx43、p-Cx43、Bax、Bcl-2、caspase-3和MAPK成員ERK、JNK和p38的活化。結果表明：①0、2.5、10 μpmol/L鎘暴露12 h后,CI值顯著或極顯著降低(P0.05或P0.01),細胞間熒光黃(LY)兩側擴散距離極顯著減少(P0.01),Cx43在細胞膜上分布減少、胞內(nèi)增多,Cx32、Cx43和p-Cx43表達顯著或極顯著降低(P0.05或P0.01)。②10 μmol/L鎘暴露9 h后,LY兩側擴散距離明顯減少,Cx32表達無顯著變化(P0.05),Cx43表達極顯著降低(P0.01),p-Cx43表達極顯著升高(P0.01),胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+].)極顯著升高(P0.01)�？p隙連接阻滯劑(GA)和鎘聯(lián)合作用對鎘引起的Cx32、Cx43和p-Cx43表達變化無明顯影響(P0.05),但能增強鎘引起的[Ca2+]。的升高(P0.01)。③10μmol/L鎘暴露9 h后,可引起B(yǎng)RL 3A細胞核形態(tài)的變化,出現(xiàn)核皺縮、核碎裂等典型的凋亡特征,并增加肝細胞的凋亡率。GA和鎘聯(lián)合作用可增強鎘誘導的胞核形態(tài)的改變、細胞凋亡率升高和Bax/Bcl-2比值和cleaved caspase-3/procaspase-3比值升高(P0.05或P0.01)。鎘可誘導ERK、JNK和p38的磷酸化水平極顯著上升(P0.01)。GA和鎘聯(lián)合作用能極顯著增加鎘引起的ERK和p38磷酸化水平的升高(P0.01),但對JNK的磷酸化水平無顯著影響(P0.05)。結論,鎘對BRL 3A細胞有明顯的細胞毒性,可抑制GJIC,其機制可能是鎘誘導BRL3A細胞Cx43分布異常,Cx32和Cx43表達及Cx43磷酸化水平的改變,以及[Ca2+],升高�？p隙連接阻滯后可增強鎘對肝細胞的毒性損傷,促進鎘誘導的細胞凋亡,這可能與凋亡相關蛋白的調(diào)控,以及ERK和p38信號途徑有關,故縫隙連接在鎘致肝細胞凋亡中起著重要作用
[Abstract]:Gap junction (OJ) mediates material exchange and information exchange between adjacent cells, which plays an important role in regulating the homeostasis of cell growth, proliferation, transformation and apoptosis. Cadmium is an important industrial and environmental pollutant, which can induce apoptosis of many kinds of cells. To investigate the effect of cadmium on the function of gap junction communication in rat hepatocytes (BRL 3A) and the role of gap junction in the apoptosis of BRL 3A cells induced by cadmium. In this study, cadmium acetate (10 渭 mol/L) at different concentrations of cadmium acetate was used to treat BRL 3A cells for 12 h or 10 渭 mol/L, and 5 渭 mol/L 18 尾 -glycyrrhetinic acid (18 P-glycyrrhizic acid, GA) alone or in combination for 9 h). The cell morphology was observed by (CI), microscope with real time analysis technique (RTCA), and the distribution of gap junction protein Cx43 was observed by scratch dye tracer (SL/DT) and (GJIC), laser confocal analysis. Hoechst 33258 was stained with nucleus, intracellular Ca2 concentration ([Ca2],) and apoptosis rate were measured by flow cytometry. The activation of ERK,JNK and p38 in Cx32,Cx43,p-Cx43,Bax,Bcl-2,caspase-3 and MAPK members were detected by Western blot. The results showed that after exposure to 10 渭 pmol/L cadmium for 12 h, the CI value decreased significantly (P0.05 or P0.01), the diffusion distance between the two sides of the fluorescent yellow (LY) decreased significantly (P0.01), and the distribution of Cx43 on the cell membrane decreased. The expression of Cx32,Cx43 and p-Cx43 decreased significantly (P0.05 or P0.01). After 9 h of cadmium exposure at 210 渭 mol/L, the diffusion distance on both sides of LY decreased significantly, but the expression of Cx32 did not change significantly (P0.05). The expression of Cx43 was significantly decreased (P0.01), the expression of p-Cx43 was significantly increased (P0.01), and the intracellular Ca2 concentration ([Ca2]) was significantly increased (P0.01). Very significantly increased (P0.01). The combined action of gap junction blocker (GA) and cadmium had no significant effect on the changes of Cx32,Cx43 and p-Cx43 expression induced by cadmium (P0.05), but could enhance [Ca2] induced by cadmium. After exposure to cadmium at 310 渭 mol/L for 9 h, the nuclear morphology of BRL 3A cells was changed, and typical apoptotic features such as nuclear shrinkage and nuclear fragmentation were observed. Combined effects of GA and cadmium could enhance the changes of nuclear morphology induced by cadmium, increase the rate of apoptosis and increase the ratio of Bax/Bcl-2 and cleaved caspase-3/procaspase-3 (P0.05 or P0.01). Cadmium could significantly increase the phosphorylation level of ERK,JNK and p38 (P0.01). GA combined with cadmium could increase the phosphorylation level of ERK and p38 induced by CD (P0.01). But there was no significant effect on the phosphorylation level of JNK (P0.05). Conclusion: cadmium has obvious cytotoxicity to BRL 3A cells, and the mechanism of inhibiting GJIC, may be the abnormal distribution of Cx43, the changes of Cx32 and Cx43 expression and Cx43 phosphorylation, and the increase of [Ca2] in BRL3A cells induced by cadmium. The blocking of gap junction can enhance the toxicity of cadmium to hepatocytes and promote the apoptosis induced by cadmium, which may be related to the regulation of apoptosis-related proteins and the signaling pathway of ERK and p38. So gap junction plays an important role in cadmium induced hepatocyte apoptosis.
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.87

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本文編號：2308042