【摘要】：為構建表達綠色熒光蛋白(GFP)的復制缺陷型西尼羅病毒(WNV),本研究參考NY99株WNV基因組序列,分段合成除結構蛋白基因外的其它基因組序列,以及插入缺失的結構蛋白基因位置的gfp報告基因序列,并按WNV基因組順序克隆于pCI-neo載體中,構建含有GFP基因的WNV復制子重組質(zhì)粒pWNVrep-GFP;同時構建表達WNVC蛋白的重組質(zhì)粒pCAG-WNV-C。將pWNVrep-GFP和pCAG-WNV-C共轉染穩(wěn)定表達WNVprM-E蛋白的W-92細胞系進行WNV粒子包裝及病毒粒子拯救。結果顯示轉染細胞能夠表達GFP,將轉染細胞培養(yǎng)液接種BHK-21細胞后,能感染細胞并且表達GFP,westernblot可以檢測到分子質(zhì)量為42ku的NS1蛋白條帶。然而,感染BHK-21細胞的培養(yǎng)液不能再感染BHK-21細胞,表明拯救的病毒只具有一次感染能力,為復制缺陷型病毒。WNV陽性血清能中和拯救病毒對BHK-21細胞的感染,該復制缺陷型病毒為WNV中和抗體檢測和疫苗評價提供了相關的技術平臺。
[Abstract]:In order to construct the replication-deficient West Nile virus (WNV),) (WNV), expressing green fluorescent protein (GFP), the genomic sequence of WNV strain of NY99 strain was studied, and other genomic sequences except structural protein gene were synthesized. The gfp reporter gene sequence of the deleted structural protein gene was inserted and cloned into the pCI-neo vector according to the WNV genomic sequence. The WNV replicon recombinant plasmid pWNVrep-GFP; containing the GFP gene was constructed. Construction of Recombinant plasmid pCAG-WNV-C. expressing WNVC protein at the same time PWNVrep-GFP and pCAG-WNV-C were co-transfected into W-92 cell line, which expressed WNVprM-E protein stably. WNV particle packaging and virus particle rescue were carried out. The results showed that the transfected cells could express GFP, after inoculating the transfected cells with BHK-21 cells, and the expression of GFP,westernblot could detect the NS1 protein bands with molecular weight of 42ku. However, the culture medium infected with BHK-21 cells can no longer infect BHK-21 cells, indicating that the rescued virus has the ability to infect BHK-21 cells only once. WNV positive serum can neutralize the infection of the rescued virus to BHK-21 cells. The replication-deficient virus provides a technical platform for WNV neutralizing antibody detection and vaccine evaluation.
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室;
【基金】：國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0500403)
【分類號】：S852.65

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本文編號：2302228