【摘要】：禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起禽類的一種復雜的多系統(tǒng)綜合征的總稱。禽致病性大腸桿菌病目前已成為雞群中非常嚴重的一種細菌病,大腸桿菌敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎等是大腸桿菌病在臨床上的主要表現(xiàn)特征,并常常伴隨不同程度的死亡率,給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,同時越來越多的證據(jù)表明APEC具有人獸共患病的潛能。外膜蛋白T(Outer membrane protein T,OmpT)定位于大腸桿菌外膜,是具有高度底物特異性的蛋白水解酶,屬于革蘭氏陰性菌外膜蛋白家族。APEC中的OmpT蛋白由位于染色質(zhì)的ompT基因(c-ompT)和位于質(zhì)粒中的ompT基因(p-ompT)分別編碼,但在行使功能方面存在一定差異。通過基因的序列比對可以發(fā)現(xiàn)位于質(zhì)粒pAPEC-O2-ColV中的ompT基因(p-ompT)與位于染色質(zhì)的ompT基因(c-ompT)同源性為79%。本研究旨在探討p-OmpT的結(jié)構和功能之間的關系,了解c-OmpT和p-OmpT的結(jié)構差異,從而闡明c-OmpT和p-OmpT之間功能上的差異問題,為了解APEC的致病機理和探求特異性防治措施奠定基礎。通過同時構建含有c-ompT或p-ompT基因的重組表達載體,并分別轉(zhuǎn)化到工程宿主菌BL21(DE3)中進行誘導表達。魚精蛋白抑制試驗顯示,含有p-ompT基因的細菌生長受到抑制,而含有c-ompT的細菌則生長不受影響。為了進一步研究p-OmpT的結(jié)構和功能之間的關系。本實驗以禽致病性大腸桿菌E058的基因組為DNA模板,PCR擴增出p-ompT基因片段,并且連接在表達載體上,構建成重組表達質(zhì)粒。然后在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了異源表達。由于誘導表達過程中形成無蛋白活性的包涵體,需要經(jīng)過變性和復性,以恢復蛋白生物活性,然后利用離子交換和凝膠過濾層析進行蛋白純化,得到高純度且聚合狀態(tài)單一的p-OmpT蛋白樣品。將純化出來的蛋白利用氣相擴散坐滴法進行蛋白結(jié)晶條件篩選,并對結(jié)晶條件進行優(yōu)化。我們獲得了 p-OmpT的蛋白晶體,并對其進行X-射線的衍射,收集數(shù)據(jù)分析。為p-OmpT晶體的進一步優(yōu)化和獲得優(yōu)質(zhì)蛋白晶體打下基礎。根據(jù)大腸桿菌OmpT能夠降解抗菌肽的特性來篩選和改造新型抗菌肽,為開發(fā)抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路。
[Abstract]:Avian Escherichia coli (E. coli) is a complex multisystem syndrome caused by avian pathogenic Escherichia coli (avian pathogenic Escherichia coli,APEC). Avian pathogenic Escherichia coli disease has become a very serious bacterial disease in chickens. E. coli septicemia, pericarditis, pericarditis and balloon inflammation are the main clinical manifestations of Escherichia coli. It is often accompanied by different degrees of mortality, causing serious economic losses to the aquaculture industry, and more evidence shows that APEC has the potential of zoonosis. The outer membrane protein (T (Outer membrane protein Tory OmpT) is located in the outer membrane of Escherichia coli and is a highly substrate-specific proteolytic enzyme. The OmpT protein in APEC is encoded by ompT gene (c-ompT) located in chromatin and ompT gene (p-ompT) in plasmid respectively. The homology of ompT gene (p-ompT) in plasmid pAPEC-O2-ColV and ompT gene (c-ompT) in chromatin was found to be 79% by sequence alignment. The purpose of this study was to explore the relationship between the structure and function of p-OmpT, to understand the structural differences between c-OmpT and p-OmpT, to clarify the functional differences between c-OmpT and p-OmpT, and to lay a foundation for understanding the pathogenesis of APEC and exploring specific preventive and therapeutic measures. The recombinant expression vector containing c-ompT or p-ompT gene was constructed at the same time and transformed into BL21 (DE3) to induce expression. Protamine inhibition test showed that the growth of bacteria containing p-ompT gene was inhibited, but the growth of bacteria containing c-ompT was not affected. In order to further study the relationship between the structure and function of p-OmpT. In this experiment, the genome of avian pathogenic Escherichia coli E058 was used as the DNA template. The p-ompT gene fragment was amplified by PCR and ligated into the expression vector to construct the recombinant expression plasmid. Then heterologous expression was carried out in Escherichia coli BL21 (DE3). In order to recover the biological activity of the protein, the inclusion bodies with no protein activity should be denatured and renatured during the induction and expression, and then purified by ion exchange and gel filtration chromatography. P-OmpT protein samples with high purity and polymerization state were obtained. The purified protein was selected by gas phase diffusion drop method and the crystallization conditions were optimized. The protein crystals of p-OmpT were obtained and analyzed by X-ray diffraction. It lays the foundation for the further optimization of p-OmpT crystal and the obtaining of high quality protein crystal. According to the characteristic that Escherichia coli OmpT can degrade antimicrobial peptides, new antimicrobial peptides can be selected and modified, which provides a new idea for the development of new antimicrobial peptides hydrolyzed by anti OmpT protease.
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.612

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本文編號：2265732