【摘要】：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)是由鐮刀菌屬真菌在生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。DON屬于天然化合物,化學結構特殊,人工合成較為困難。然而商品化DON價格昂貴,不能滿足實驗室大量DON毒理學研究的需要。DON可以通過污染的糧食作物引起人和動物的中毒。豬是對DON最敏感的動物,DON可以明顯引起豬的拒食、體重下降等癥狀。DON有免疫調(diào)節(jié)的作用,高濃度的DON可導致免疫抑制,表現(xiàn)為循環(huán)淋巴細胞減少;低濃度的DON可以刺激某些細胞因于和炎癥相關基因的表達。有報道表明,DON和某些鐮刀菌屬毒素可以增加機體對病毒的易感性。豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)是危害養(yǎng)殖業(yè)的一個重要病毒,可嚴重損害種畜的生殖機能和仔豬的呼吸功能。本研究制備純化DON樣品,并將其利用到毒理學研究中。研究了 DON對生長在細胞上的PRRSV復制的影響,DON對感染PRRSV的細胞的細胞因子mRNA表達的影響及細胞凋亡情況,探討DON對PRRSV在體外復制的影響的機理。對感染PRRSV的仔豬飼喂含不同濃度的DON的日糧,研究DON在動物體內(nèi)對PRRSV的感染的影響。試驗Ⅰ小麥樣品中DON的分離純化禾谷鐮刀菌PH-1產(chǎn)生的孢子液接種到小麥培養(yǎng)基上,小麥發(fā)生霉變后,HPLC測產(chǎn)毒量。霉變小麥粉碎后,加入乙腈/水(84:16,v/v)萃取液,經(jīng)振蕩、抽濾、脫脂、旋轉蒸干后,得到棕色粘稠狀浸膏。該浸膏與粗顆粒硅膠拌料后,經(jīng)過第一次硅膠柱,分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇進行洗脫,TLC檢測DON樣品存在乙酸乙酯溶液中。濃縮該溶液,與較細顆粒的硅膠拌料后,經(jīng)過第二次硅膠柱層析,用二氯甲烷/甲醇(19:1,v/v)作為洗脫液,得到DON的粗提物。粗提物經(jīng)過制備型HPLC,收集含有DON單峰的樣品,經(jīng)分析型HPLC檢測,與DON標準品有相同的出峰時間,可以初步判定該樣品為DON。該樣品經(jīng)HPLC-MS、NMR結構鑒定,和間接競爭ELISA免疫學鑒定為DON。本研究中,1kg小麥培養(yǎng)基得到433 mg DON粗提物,經(jīng)純化后得到293 mg DON樣品,本試驗的回收率接近70%。經(jīng)計算,該DON的純度達90%以上,可以用來進行毒理學研究。試驗ⅡDON對PRRSV在體外復制的影響為了研究DON對PRRSV體外復制的影響,本試驗選取PRRSV的體外培養(yǎng)細胞MARC-145細胞進行研究。分別研究了不同濃度的DON對未感染病毒的細胞的活力LDH活性的影響;對已感染PRRSV的細胞的活力、LDH活性的影響;DON對接種在細胞上PRRSV抗原量以及病毒滴度的影響;DON對PRRSV N蛋白復制的影響。結果顯示,較高濃度的DON(500～800ng·mL-1)可導致正常細胞的形態(tài)發(fā)生變化,甚至脫落;細胞的活力降低(P0.05);LDH活性升高(P0.05),因此本試驗研究濃度小于500 ng·mL-1的DON對PRRSV復制的影響。PRRSV感染細胞后,出現(xiàn)明顯細胞病變,加入50 ng·mL-1DON時,細胞的病變情況和細胞活力沒有明顯變化。當DON濃度為150～200 ng·mL-1時,感染PRRSV的細胞存在病變,但細胞活力顯著高于對照組(P0.05);LDH活性顯著低于對照組(P0.05);間接免疫熒光試驗表明PRRSV抗原量減少;病毒滴度顯著低于對照組(P0.05);Western blotting試驗結果表明,N蛋白復制受到抑制。以上試驗結果說明DON濃度為150～200 ng·mL-1時,可以抑制PRRSV在細胞上的復制。試驗ⅢDON對感染PRRSV細胞的細胞因子及細胞凋亡的影響PAM為PRRSV感染的天然靶細胞,為了進一步探討DON對PRRSV復制影響的機理,本試驗研究DON對PAM的細胞因子mRNA表達的影響。分別研究了DON濃度為200 ng·mL-1時,對抗病毒細胞因子IFN-α和IFN-β和促炎性細胞因子IL-1β和IL-6的mRNA表達的影響。結果顯示,對于未感染PRRSV的細胞,200 ng·mL-1DON染毒組的IFN-α和IFN-βmRNA表達水平與對照組無顯著性差異;細胞感染PRRSV后,IFN-α和IFN-β相對表達水平有所升高,但與對照組差異不顯著;感染PRRSV的細胞中加入DON后,IFN-α和IFN-β的表達水平升高,與對照組差異顯著(P0.05),抗病毒細胞因子的升高與DON抑制PRRSV的復制有關。DON可以使未感染PRRSV的細胞中IL-1β和IL-6相對表達升高,與對照組差異顯著(P0.05);PRRSV感染細胞中IL-1β和IL-6的mRNA表達水平升高,但與對照組無顯著性差異;DON使感染PRRSV的細胞中IL-1β和IL-6的mRNA表達水平升高,與對照組差異顯著(P0.05)。DON引起的炎性細胞因子的表達升高與其抑制PRRSV在細胞上的復制有關。本試驗還應用流式細胞術檢測了DON對感染PRRSV的細胞的凋亡情況。細胞感染PRRSV后,加入DON濃度為50 ng·mL-1時細胞凋亡率與不加DON的對照組差異不顯著,DON濃度為150～200 ng·mL-1細胞凋亡率顯著高于對照組(P0.05)。DON引起的細胞凋亡威脅細胞上PRRSV的存活,導致PRRSV在細胞上的復制受到抑制。試驗ⅣDON對PRRSV體內(nèi)感染的影響為了研究DON對PRRSV體內(nèi)感染的影響,本試驗選取28日齡斷奶仔豬進行試驗研究。將實驗動物隨機分為4組,每組10頭豬,4組動物隔離飼養(yǎng)。試驗組1為對照組,飼喂基礎日糧。其余3組試驗組的豬各滴鼻、肌肉接種1 mL JXA1株MARC-145細胞培養(yǎng)液,病毒滴度為1×105TCID50·mL-1。試驗組2飼喂基礎日糧;試驗組3飼喂基礎日糧添加3 mg·kg-1 DON;試驗組4飼喂基礎日糧添加5 mg·kg-1 DON。分別測量4組實驗動物的生長性能、體溫、血液及肺臟樣本中的PRRSV病毒載量、血清樣本中抗PRRSV特異性抗體的免疫應答及免疫組化檢測肺組織中的PRRSV含量。結果顯示,飼喂添加DON的日糧可導致感染PRRSV的仔豬生長性能降低;體溫升高;血液中PRRSV病毒載量增加;肺臟組織中PRRSV含量增加;血清中針對PRRSV的特異性抗體應答增強。感染PRRSV的仔豬飼料中添加DON導致仔豬PRRSV感染的癥狀加劇,甚至死亡。本試驗結果與體外試驗結果相矛盾,這是由于體內(nèi)和體外試驗環(huán)境不同引起的,本試驗中日糧中添加DON的濃度尚未達到DON對PRRSV復制的抑制作用,DON在該濃度作用主要發(fā)揮引起動物拒食、嘔吐等毒性作用。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【參考文獻】

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本文編號：2257266