【摘要】：鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)又稱鴨瘟病毒(Duck plague virus,DPV),是阻礙養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要病原之一。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)了DEV核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,NP)及其宿主細胞受體即蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor,PKCI)。PKCI是宿主細胞內蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)的抑制蛋白質,PKC是宿主細胞磷酸化通路的關鍵分子,參與多種病毒的增殖過程。但宿主細胞磷酸化通路是否影響DEV侵染過程,尚無文獻報道。為此,本研究利用PKC經(jīng)典抑制劑(Staurosporine,SP)和專性激活劑(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)開展磷酸化通路在DEV感染中的作用研究,以期為闡明DEV侵染機理提供一些新的線索和思路。1.鴨源PKC基因熒光定量PCR檢測方法的建立:根據(jù)GenBank上PKC基因設計和合成特異性引物,通過PCR擴增從鴨胚成纖維(DEF)細胞mRNA提取樣本中獲取目的基因片段,構建重組質粒GV pXT19-T-PKC,并以其為陽性標準品建立熒光定量PCR檢測方法和標準曲線,然后進行重復性、特異性和敏感性驗證,結果顯示:熒光定量PCR標準曲線的線性關系為Y=-3.3340x+44.199,相關系數(shù)為0.9954,擴增效率為99.19%;熔解曲線僅出現(xiàn)單特異峰,對H5亞型AIV、H7亞型AIV、H9亞型AIV、NDV和DHV均未檢測到熒光信號。這表明本試驗建立的熒光定量PCR方法具有良好的穩(wěn)定性、特異性和靈敏性。2.SP和PMA對DEV毒力的影響:取DEV貴州強毒株,接種DEF細胞,測定TCID50值;取培養(yǎng)成單層的DEF細胞,分別用SP和PMA(濃度均為100nmol/L)處理4h,分別加入系列稀釋的DEV進行孵育,觀察和測定TCID50值變化;分別以不同濃度的SP和PMA處理DEF細胞后,再加入0.01MOI的DEV進行孵育,觀察和分析病毒TCID50值變化,結果:DEV貴州強毒株的TCID50值為3.16×10-9/0.1mL;經(jīng)SP處理,隨處理濃度的加大,病毒TCID50值隨之下降,但濃度到100nmol/L時,病毒TCID50值回升;經(jīng)PMA處理,在20至50nmol/L時病毒TCID50值隨之上升,但到100至200nmol/L時,病毒TCID50值反而下降。這表明經(jīng)SP和PMA處理,可影響DEV毒力即DEV的增殖。3.SP和PMA對PKC、PKCI和DEV-NP基因轉錄的影響:取培養(yǎng)成單層的DEF細胞,經(jīng)SP和PMA處理后,再用DEV感染,然后收集細胞培養(yǎng)物,應用前期建立的熒光定量PCR方法檢測分析PKC、PKCI和DEV-NP基因的轉錄水平,結果:SP處理組PKC、PKCI和DEV-NP基因的轉錄水平分別為2.62×109copies/μL、2.61×102copies/μL和6.65×100copies/μL;PMA處理組相應為3.92×108copies/μL、5.24×101copies/μL和2.55×108copies/μL;病毒對照組相應為8.11×106copies/μL、5.83×101copies/μL和2.74×102copies/μL。這表明,SP處理能降低DEV增殖水平,而PMA處理能提高DEV增殖水平。
[Abstract]:Duck enteritis virus (Duck enteritis virus), also known as duck plague virus (Duck plague virus), is one of the most important pathogens hindering the healthy development of duck industry. Previous laboratory studies have found that DEV nucleocapsid protein NP and its host cell receptor, the protein kinase C inhibitor (Protein kinase C, are the key molecules of the host cell phosphorylation pathway. Participate in the proliferation of many viruses. However, whether the phosphorylation pathway of host cells affects the process of DEV infection has not been reported. Therefore, the phosphorylation pathway of PKC classical inhibitor (SP) and specific activator (Phorbol-12-Eritrestate-13-acetatePMA) were used to study the role of phosphorylation pathway in DEV infection, in order to provide some new clues and ideas for elucidating the mechanism of DEV infection. Establishment of fluorescent quantitative PCR Detection method for Duck PKC Gene: according to the design and synthesis of specific primers of PKC gene on GenBank, the target gene fragment was obtained by PCR amplification from mRNA samples of (DEF) cells derived from duck embryo fibroblasts. The recombinant plasmid GV pXT19-T-PKC was constructed, and the fluorescent quantitative PCR detection method and standard curve were established by using GV pXT19-T-PKC as positive standard. Then the reproducibility, specificity and sensitivity were verified. The results showed that the linear relationship of the standard curve of fluorescence quantitative PCR was Y-3.3340x 44.199.The correlation coefficient was 0.9954, and the amplification efficiency was 99.19.The melting curve showed only a single specific peak, and no fluorescence signals were detected for the H5 subtype AIV-H7 subtype AIVH9 subtype AIVNV and DHV. The results showed that the fluorescent quantitative PCR method established in this study had good stability, specificity and sensitivity. 2.The effects of SP and PMA on the virulence of DEV were as follows: take DEV Guizhou virulent strain, inoculate DEF cells, measure TCID50 value, and culture into monolayer DEF cells. After treated with SP and PMA (concentration of 100nmol/L) for 4 h, a series of diluted DEV was added to incubate, observe and measure the change of TCID50 value, after treated with SP and PMA at different concentrations, DEF cells were incubated with 0.01MOI DEV. By observing and analyzing the change of virus TCID50 value, the results showed that the TCID50 value of Guizhou virulent strain was 3.16 脳 10 ~ (-9) / 0.1 mL. After SP treatment, the virus TCID50 value decreased with the increase of treatment concentration, but when the concentration reached 100nmol/L, the virus TCID50 value increased, and PMA treatment, At 20 to 50nmol/L, the virus TCID50 increased, but at 100 to 200nmol/L, the virus TCID50 decreased. This indicated that SP and PMA could affect the virulence of DEV, I. E. the proliferation of DEV and the effect of PMA on the transcription of PKCPKCI and DEV-NP genes: DEF cells were cultured into monolayer DEF cells, then infected with DEV after SP and PMA treatment, and then the cell cultures were collected. The transcriptional levels of PKCU PKCI and DEV-NP genes were detected by fluorescence quantitative PCR assay. The results showed that the transcriptional levels of PKCU PKCI and DEV-NP gene were 2.62 脳 109copies/ 渭 L 2.61 脳 102copies/ 渭 L and 6.65 脳 100copies/ 渭 L PMA-treated group, respectively, and were 3.92 脳 108copies/ 渭 L 5.24 脳 101copies/ 渭 L and 2.55 脳 108copies/ 渭 L, respectively, and 8.11 脳 106copies/ 渭 L 5.83 脳 101copies/ 渭 L and 2.74 脳 102copies/ 渭 L in the virus control group. The results showed that the transcriptional levels of PKCI gene and DEV-NP gene in the control group were 8.11 脳 106copies/ 渭 L 5.83 脳 101copies/ 渭 L and 2.74 脳 102copies/ 渭 L, respectively. This indicated that SP treatment could decrease the proliferation of DEV, while PMA treatment could increase the proliferation of DEV.
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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