【摘要】：旋毛蟲是一種全球范圍分布的危害嚴重的食源性人獸共患寄生蟲病。主要發(fā)病原因是因為宿主食用了生的或未熟的含有感染性包囊的肉類食品而感染,感染嚴重時可致死亡。幾乎所有的哺乳動物均可以被感染。近年相繼在幾種寄生蟲分離并鑒定除了絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。研究表明,絲氨酸蛋白酶抑制劑具有獨特的酶抑制活性,能夠保護寄生蟲抵制宿主消化液的消化,參與寄生蟲在宿主體內的移行過程,能夠利于寄生性線蟲的發(fā)育并抵抗宿主的免疫反應。根據NCBI上已發(fā)表的旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑Tsp Ad5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548(其基因序列登錄號分別為:EU263307、AF231948.1、XM_003379333、XM_003379851)設計實時熒光定量引物,應用分子生物學技術分別將克隆的目的片段與p MD-18T克隆載體連接后,各自轉化入克隆感受態(tài)細胞DH5α中。經菌液PCR鑒定和測序公司測序后對克隆到的序列進行序列分析正確,隨后制備相應的標準品,并建立相對應的實時熒光定量標準曲線。為闡明四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內轉錄水平表達量的情況,將收集的不同時期的旋毛蟲蟲體提取總RNA進行RT-PCR,分析不同發(fā)育時期里旋毛蟲四種Ts-SPI基因在mRNA水平的表達量差異。結果顯示,Tsp Ad5和TS11-1在旋毛蟲感染后3d的成蟲期出現一個轉錄高峰,3d時表達量明顯高于1d和5d的表達量(p㩳0.01),5d時較NBL略低(p0.05);成囊前期,表達量很低,其中18d時表達量最低(p㩳0.05);另一高峰出現在感染后第38天的肌幼蟲時期,且差異具有顯著性(p㩳0.05)。Tsp03044在成蟲時期,3d時的轉錄水平表達量明顯高于其他時期的表達量且差異具有極顯著性(p㩳0.01);成囊前期中18d時表達量最低(p㩳0.05),22d時轉錄出現高峰(p㩳0.01),差異極顯著。Tsp03548在3d時轉錄略高于1d和5d的表達量(p㩳0.05),5d時較NBL略低(p㩳0.05)且具有差異顯著性;成囊前期中18d時出現轉錄表高峰(p㩳0.01);肌幼蟲時期均有表達(p㩳0.05)且差異顯著。本實驗應用免疫熒光技術研究四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內分布的情況,并對四種Ts-SPI與宿主的相互作用進行分析。免疫熒光定位結果顯示,TspAd5和TS11-1在成蟲表皮組織和肌肉蟲的表皮和體內均大量表達,在新生幼蟲和成囊前期幼蟲的蟲體也有表達。Tsp03044在新生幼蟲的蟲體的體內和表皮表達量略少,在其他時期的體內均明顯可見其紅色熒光效果顯著。Tsp03548明顯可見定位于成囊前期幼蟲的表皮組織和體內;成蟲的表皮組織和新生幼蟲的蟲體的表皮和體內也有表達,但整體紅色熒光效果很弱;肌幼蟲的體內和表皮也均有表達。本實驗對四種Ts-SPI在旋毛蟲不同發(fā)育時期蟲體內轉錄水平表達量和蟲體分布的情況進行研究,通過應用實時熒光定量PCR和免疫熒光定位技術對Tsp Ad5、TS11-1、Tsp03044、Tsp03548在不同發(fā)育時期轉錄水平表達量變化和蟲體表達部位的進行分析,不僅為闡明旋毛蟲不同發(fā)育階段的蛻變機制奠定基礎,也為闡明旋毛蟲侵襲宿主的過程中的免疫逃逸機制以及新型的抗旋毛蟲及相關寄生蟲藥物研發(fā)打下結實基礎。
[Abstract]:The results showed that Tsp Ad5 and TS11 - 1 were able to inhibit the development of parasitic nematodes and to resist the immune response of host . The results showed that Tsp Ad5 and TS11 - 1 were able to inhibit the development of parasitic nematodes and to resist the immune response of hosts .
【學位授予單位】：東北農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

【參考文獻】

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1 李達;旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑免疫學及生物活性研究[D];東北農業(yè)大學;2015年

2 馬靜;旋毛蟲Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆、表達及特性研究[D];東北農業(yè)大學;2015年

3 劉暢;旋毛蟲ES抗原及HSP70對樹突狀細胞免疫調節(jié)的研究[D];東北農業(yè)大學;2014年

4 牛延萍;捻轉血矛線蟲過氧化物酶基因的克隆和5種蛋白的抗原特性分析[D];南京農業(yè)大學;2012年

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本文編號：2127614