【摘要】：乳脂是牛奶中重要的營養(yǎng)成分之一,乳脂含量是衡量牛奶質(zhì)量的重要指標。乳脂合成受到多種信號通路的調(diào)節(jié),其中雷帕霉素靶蛋白(themechanistic target of rapamycin,mTOR)信號通路對乳脂合成發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。mTOR是一種絲/蘇氨酸激酶,屬于磷酸肌醇3(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase,PIKK)蛋白激酶家族。mTOR作為核心組分與其他不同蛋白形成兩種復(fù)合物,mTOR complex 1(mTORC1)和mTOR complex 2(mTORC2).mTORC1和mTORC2在胞內(nèi)發(fā)揮不同的作用,mTORC1主要在調(diào)控細胞的增殖、代謝及蛋白合成等方面發(fā)揮作用;mTORC2則參與調(diào)控細胞骨架、細胞遷移及代謝等過程。目前,關(guān)于mTORC1在乳脂合成調(diào)控方面的研究報道比較多,而mTORC2尚顯不足,二者在奶牛乳腺上皮細胞中對乳脂合成的調(diào)控作用對比也鮮有報道。本實驗利用實驗室分離并純化得到的奶牛乳腺上皮細胞作為研究模型,首先應(yīng)用ATP競爭性mTOR抑制劑AZD8055處理細胞,同時抑制mTORC1和mTORC2活性,Western blot檢測各組mTORC1和mTORC2信號通路活性,同時利用ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)液中甘油三酯(TG)、軟脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量;其次,一方面利用mTORC1特異性抑制劑rapamycin處理細胞,抑制mTORC1信號通路活性,并利用RNA干擾技術(shù)靶向沉默mTORC1核心組分raptor基因來抑制mTORC1活性;另一方面靶向沉默mTORC2核心組分rictor基因來抑制mTORC2活性。利用Western blot檢測各組mTORC1和mTORC2信號通路活性,同時利用ELISA檢測各組細胞培養(yǎng)液中甘油三酯(TG)、軟脂酸(PA)、二十二碳六烯酸(DHA)含量,再利用質(zhì)譜檢測rapamycin處理組,rictor基因沉默組胞內(nèi)各類脂肪酸的含量;最后,對比在mTORC1和mTORC2都被抑制的情況下和mTORC1、mTORC2分別被抑制情況下TG、PA、DHA含量變化,對比分析mTORC1和mTORC2在乳脂合成中的作用。實驗結(jié)果表明:1)用AZD8055處理細胞后,MTT法檢測顯示100 nM AZD8055 處理 12h,100nM AZD8055 處理 24h,200nM AZD8055 處理 12h和200 nM AZD8055處理24 h時均可抑制細胞增殖,其中200 nM處理24 h組效果最顯著(p0.05);Western blot結(jié)果顯示,用AZD8055處理細胞后,mTORC1和mTORC2活性均被抑制(p0.05);ELISA結(jié)果顯示對照組細胞培養(yǎng)液中的 TG、PA 和 DHA 含量分別為 19.26±0.85 mmol/L、28.89±1.59 ng/ml和 258.75 ±22.1 pg/ml,100 nM AZD8055 處理 24 h 組細胞培養(yǎng)液中 TG、PA 和DHA 含量分別為 16.07±2.05 mmol/L、22.68±3.2 ng/ml 和 188.63±14.57 pg/ml,200 nM AZD8055處理12 h組細胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量分別為14.74±2.61mmol/L、19.54±1.53ng/ml 和 183.82±26.94pg/ml。和對照組相比,處理組細胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(p0.05);2)利用rapamycin處理抑制mTORC1活性,對照組細胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為 5.42±0.08mmol/L、2.74±0.13ng/ml 和 403.3±11.17pg/ml,細胞內(nèi)31種脂肪酸總量3070.54±105.07 mg/kg;100 nM rapamycin處理8 h組細胞培養(yǎng)液中 TG、PA 和 DHA 含量分別為 4.53±0.13 mmol/L、2.74±0.13 ng/ml 和297.82±20.8pg/ml,細胞內(nèi) 31 種脂肪酸總量 2844.23±282.92 mg/kg。和對照組相比,處理組細胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(p0.05),細胞內(nèi)31種脂肪酸總量降低,但差異不顯著(P0.05);3)靶向siRNA沉默Raptor基因,抑制mTORC1活性,對照組細胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為 8.54±0.8 mmol/L、15.37±1.85 ng/ml 和 527.99±32.67 pg/ml,Raptor 基因沉默組細胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為6.56±0.42 mmol/L、11.07±1.46 ng/ml和331.84±48.02pg/ml。和對照組相比,處理組細胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(p0.05);4)靶向siRNA沉默Rictor基因,抑制mTORC2活性,對照組細胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為3.4±0.43 mmol/L、8.91±1.14ng/ml 和 109.47±7.46pg/ml,細胞內(nèi) 31 種脂肪酸總量 3070.54±105.07 mg/kg;Rictor基因沉默組細胞培養(yǎng)液中的TG、PA和DHA含量分別為2.49±0.24 mmol/L、6.93±0.14 ng/ml 和 55.74±6.01 pg/ml,細胞內(nèi) 31 種脂肪酸總量3028.66±120.05mg/kg。和對照組相比,處理組細胞培養(yǎng)液中TG、PA和DHA含量均顯著降低(b0.05),細胞內(nèi)31種脂肪酸總量降低,但差異不顯著(P0.05);5)三種方法對比mTORC1和mTORC2在TG、PA和DHA合成中的作用。一方面根據(jù)TG、PA和DHA抑制率分析,對TG、PA和DHA合成的作用mTORC2mTORC1;另一方面綜合考慮通路活性以及TG、PA和DHA 抑制率,對 TG 和 DHA 作用 mTORC2mTORC1,對 PA 作用 mTORC1mTORC2.綜上所述,mTORC1和mTORC2均在奶牛乳腺上皮細胞甘油三酯和脂肪酸合成中發(fā)揮作用。利用不同的方法對比分析mTORC1和mTORC2的作用強度,mTORC2的作用可能強于mTORC1。由于mTORC1和mTORC2兩條信號通路具有"串話(cross talking)"機制,二者在乳脂合成中的協(xié)調(diào)機制還有待進一步的研究。
[Abstract]:In this study , mTORC1 and mTORC2 were used to study the activity of mTORC1 and mTORC2 . mTORC1 and mTORC2 were used to detect the activity of mTORC1 and mTORC2 . 1 ) After treated with AZD8055 , MTT assay showed that the contents of TG , PA and DHA in the treated group were respectively 14.74 鹵 2.61mmol / L , 28.89 鹵 1.59ng / ml and 188.63 鹵 14.57 pg / ml and 188.63 鹵 14.57 pg / ml and 188.63 鹵 14.57 pg / ml , respectively . The results showed that the contents of TG , PA and DHA in the treated group were respectively 14.74 鹵 2.61mmol / L , 19.54 鹵 1.53ng / ml and 183.82 鹵 26.94pg / ml , respectively . The contents of TG , PA and DHA in the culture fluid of treated group were 4.53 鹵 0.13 mmol / L , 2.74 鹵 0.13ng / ml and 297.82 鹵 20.8pg / ml , respectively . The contents of TG , PA and DHA were 2.49 鹵 0.24 mmol / L , 6.93 鹵 0.14 ng / ml and 55.74 鹵 6.01 pg / ml , respectively .
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S823

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