發(fā)布時間：2018-07-03 12:17

  本文選題：FAM3A + 脂肪細胞分化�。� 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：FAM3A是蛋白質(zhì)序列相似度為3的細胞因子家族成員之一,它在肝臟中受到PPARG調(diào)控,參與脂肪代謝。本實驗旨在研究FAM3A在前體脂肪細胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制及其在脂肪細胞分化過程中的調(diào)控作用。主要研究結果如下：1.在3T3L1細胞中過表達C/EBPbeta,檢測FAM3A基因表達量變化,發(fā)現(xiàn)C/EBPbeta能促進FAM3A表達(P0.01)。2.構建FAM3A啟動子缺失雙熒光報告載體D1(-1478/+46)、D2(-1187/+46)、D3 (-951/+46)、D4 (-442/+46)、D5 (-285/+46)和D6 (-32/+46),分別轉(zhuǎn)染3T3L1、C2C12和CHO三種細胞,檢測熒光活性,結果FAM3A啟動子各缺失在三種細胞中都有活性且有相似活性趨勢,D5(-285/+46)活性最高,D6(-32/+46)活性最低,只有基本啟動子活性。由此推斷核心啟動子位于-32bp至+46bp區(qū)域,-285bp至-32bp區(qū)域是啟動子正向調(diào)控元件富集區(qū),而-1478bp至-285bp區(qū)域分布著較多的抑制啟動子活性的元件。3.將C/EBPbeta真核表達載體與FAM3A啟動子各缺失共轉(zhuǎn)染,FAM3A啟動子各缺失活性顯著增強(P0.01),其中C/EBPbeta對缺失片斷D-118,7/+46的作用最顯著(P0.01),將D-1187／+46活性提高了3.55倍。繼續(xù)將啟動子上C/EBPbeta結合位點定點突變并與C/EBPbeta真核表達載體共轉(zhuǎn)染3T3L1細胞,結果突變啟動子活性幾乎不受C/EBPbeta影響。接著應用EMSA實驗進一步證明C/EBPbeta蛋白能與啟動子上C/EBPbeta結合位點結合。4.構建FAM3A真核表達載體并轉(zhuǎn)染3T3L1細胞,用MDI誘導3T3L1細胞分化,結果該細胞成脂分化效率受到FAM3A抑制,分化8天后甘油三脂含量顯著降低。檢測脂肪分化標志基因表達情況,發(fā)現(xiàn)同對照組相比,PPARG2和FABP4在FAM3A基因在細胞分化2天后表達量顯著下調(diào)(P0.05),C/EBPα/SCD1、 DGAT1、LPL和FABP4基因在分化8天后下調(diào)表達,并達到顯著水平(P0.05)。FAM3A基因在3T3L1細胞分化8天后對HSL、ACC2、AdipoR1、FAS, ACOX1和UCP2基因表達沒有影響。5.將FAM3A真核表達載體轉(zhuǎn)染3T3L1細胞,72小時后收集細胞測定細胞周期,結果實驗組的G1期細胞數(shù)量從63.5%上升到72.7%,同時S期占的細胞比例從24.8%下降至18.3%,兩組細胞的G2期細胞數(shù)量沒有顯著差異,表明FAM3A能抑制3T3L1細胞周期。
[Abstract]:FAM3A is a member of cytokine family whose protein sequence similarity is 3. FAM3A is regulated by PPARG in liver and participates in fat metabolism. The aim of this study was to investigate the transcriptional mechanism of FAM3A in precursor adipocytes and its role in adipocyte differentiation. The main results are as follows: 1. The expression of FAM3A gene was detected in 3T3L1 cells. It was found that C / EBP beta could promote the expression of FAM3A (P0.01) .2. The double fluorescent report vector D1 (-1478 / 46) D 2 (-118787 / 46) D3 (-951 / 46) D4 (-442 / 46) D5 (-28546) and D6 (-32 / 46) were constructed and transfected into three kinds of cells, 3T3L1C2C12 and Cho, respectively. Results the deletion of FAM3A promoter had the highest activity of D5 (-285 / 46) and the lowest activity of D6 (-32 / 46) in all three kinds of cells. It is concluded that the core promoter is located in the region of -32bp to 46bp, the region of -285bp to -32bp is the rich region of the positive regulatory element of the promoter, while the region of -1478bp to -285bp distributes more elements that inhibit the promoter activity. The deletion activity of C / EBPbeta and FAM3A promoter was significantly increased (P0.01), and the activity of D-1187 / 46 was the most significant (P0.01). The activity of D-1187 / 46 was increased by 3.55 times. The C / EBP beta binding site on the promoter was continuously mutated and co-transfected with the C / EBPbeta eukaryotic expression vector into 3T3L1 cells. The results showed that the promoter activity was almost independent of C / EBP beta. Then the EMSA assay was used to further prove that the C / EBP beta protein could bind to the C / EBP beta binding site on the promoter. FAM3A eukaryotic expression vector was constructed and transfected into 3T3L1 cells. The differentiation of 3T3L1 cells was induced by MDI. As a result, the adipogenic differentiation efficiency of the cells was inhibited by FAM3A, and the triglyceride content decreased significantly after 8 days of differentiation. Compared with the control group, the expression of PPARG2 and FABP4 in FAM3A gene was significantly down-regulated 2 days after differentiation (P0.05), the expression of C / EBP 偽 / SCD1, DGAT1 / LPL and FABP4 genes were down-regulated 8 days after differentiation. FAM3A gene had no effect on the expression of HSLACC2AdipoR1 FASA, ACOX1 and UCP2 genes in 3T3L1 cells 8 days after differentiation. FAM3A eukaryotic expression vector was transfected into 3T3L1 cells for 72 hours. Results the number of G1 phase cells in the experimental group increased from 63.5% to 72.7%, while the percentage of S phase cells decreased from 24.8% to 18.3cells. There was no significant difference in the number of G2 phase cells between the two groups, which indicated that FAM3A could inhibit the cell cycle of 3T3L1 cells.
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.2

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