本文選題：豬鏈球菌2型 + 環(huán)二腺苷酸��； 參考：《上海交通大學》2015年博士論文

【摘要】：環(huán)二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)是一種新發(fā)現(xiàn)的細菌第二信使分子,其在細菌內(nèi)的代謝受二腺苷酸環(huán)化酶(diadenylate cyclase,DAC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)的調(diào)控。c-di-AMP參與調(diào)節(jié)多種生理功能,包括細菌的生長、細胞壁的代謝平衡以及細菌的致病力等。豬鏈球菌(Streptococcus suis,SS)是一種重要的豬源病原菌,根據(jù)其莢膜抗原的不同,豬鏈球菌分為33個血清型(1~31、33以及1/2型),其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)被公認為是毒力最強、臨床分離率最高的一種人畜共患病原菌,可致關節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肺炎和敗血癥等。雖然SS2存在眾多毒力相關因子,但作為一種重要的細菌第二信使分子,c-di-AMP及其代謝基因在SS2中的存在情況及其可能發(fā)揮的生物功能尚不清楚。本研究以SS2高致病性菌株HA9801作為研究對象,首次對c-di-AMP及其代謝相關基因及其對SS2的生物學特性和致病力的影響進行了研究。為了確認SS2中是否存在第二信使分子c-di-AMP,采用高效液相色譜(HPLC)法對SS2 HA9801細胞內(nèi)容物進行了分析,發(fā)現(xiàn)在與c-di-AMP標準品相同滯留時間處出現(xiàn)一個疑似峰,分離該物質(zhì)并經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析,確認其為c-di-AMP,表明SS2 HA9801能夠合成c-di-AMP。進一步定量研究發(fā)現(xiàn),隨著SS2的生長,c-di-AMP在細菌細胞內(nèi)的含量略有升高,至對數(shù)生長中期后維持在一個較穩(wěn)定的水平。參考GenBank上公布的SS2菌株98HAH33的基因組序列(NC_009443.1),基于生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)SS2中存在可能與c-di-AMP代謝相關的二腺苷酸環(huán)化酶基因(dacA)和水解酶基因(gdpP)。以SS2 HA9801菌株基因組為模板,克隆并分析了預測基因,結果發(fā)現(xiàn)dacA基因編碼一個283 aa的蛋白質(zhì),含3個跨膜區(qū)和一個具有環(huán)化酶活性的DisA_N結構域。gdpP基因編碼一個654 aa的蛋白質(zhì),含有兩個在GdpP同源蛋白中保守的跨膜結構域:PAS結構域和對水解c-di-amp發(fā)揮關鍵作用的dhh/dhha1結構域。兩個蛋白的氨基酸序列與其它革蘭氏陽性菌中的daca和gdpp蛋白具有較高的同源性。此外,共轉錄分析結果顯示daca和gdpp分別與其下游基因處于同一轉錄單位。為了揭示預測基因的功能,表達并純化了daca蛋白和gdpp蛋白。經(jīng)hplc和esi-ms分析顯示,重組蛋白daca99-283在體外可以催化atp生成c-di-amp,其活性依賴于二價陽離子的存在,在mg2+存在的情況下活性較強。重組蛋白gdpp可在體外水解c-di-amp生成papa,而mn2+是其發(fā)揮作用的最適金屬陽離子。堿性環(huán)境較酸性環(huán)境更適合兩個蛋白的酶活性發(fā)揮。通過定點突變和分段表達等研究發(fā)現(xiàn),rhr和dga基序是daca的活性相關位點,其中rhr是atp結合位點;dhh/dhha1是gdpp發(fā)揮水解c-di-amp活性的結構域。為了進一步研究c-di-amp及其代謝基因在ss2中發(fā)揮的生物學作用,基于同源重組技術,構建了daca以及gdpp基因的缺失突變株。為了不影響各自下游基因的轉錄,采用了只破壞閱讀框的不完全敲除(in-frame)技術。經(jīng)組合pcr等方法的確認,最終獲得了gdppin-frame缺失突變株,但是未能獲得daca缺失突變株,究其原因,可能由于daca是ss2生長所必須的基因。此外,經(jīng)pcr擴增獲得包含上游啟動子的gdpp基因,并克隆至穿梭質(zhì)粒pset2s。將重組質(zhì)粒電轉化至gdpp缺失突變株,通過rt-pcr鑒定,獲得了gdpp功能代償互補株。為了揭示gdpp的生物學功能,分析了gdpp缺失對ss2表型和毒力的影響,結果顯示,gdpp的缺失導致ss2細胞內(nèi)c-di-amp含量升高約2倍,表明gdpp參與ss2細胞內(nèi)c-di-amp的代謝平衡。在相同培養(yǎng)條件下觀察野生株和gdpp缺失突變株的表型差異,結果顯示,光鏡下缺失株細菌聚集成簇,與野生株有明顯差異;掃描電鏡與透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)缺失突變株細胞形態(tài)發(fā)生改變,部分菌體有脹大現(xiàn)象。體外實驗顯示,與野生株相比,gdpp基因缺失株生長速率緩慢,對數(shù)期滯后;生物被膜的形成能力增高1.86倍;培養(yǎng)上清的溶血活性降低;對hep-2細胞的黏附和侵入能力也分別下降了36.8%和57.0%。小鼠攻擊試驗結果顯示,gdpp基因缺失株的半數(shù)致死量為7.23×108cfu,高于野生株的3.00×107cfu,且小鼠感染缺失株后的存活率高于野生株;gdpp基因的缺失還使ss2ha9801在小鼠特定組織的定殖能力由5.0logcfu/g下降至3.9logcfu/g。此外,感染缺失株的小鼠,其腦、肺和脾臟組織的病理切片均顯示正常,而感染野生株的小鼠各組織臟器均發(fā)生嚴重的病理損傷。上述結果表明gdpP以及c-diAMP的代謝水平對SS2的生物學特性和致病力發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。為了揭示gdpP的缺失引起SS2諸多表型變化的原因,基于RNA-seq和熒光定量PCR技術,從轉錄水平比較了野生株和gdpP缺失株的基因表達差異。結果顯示,與野生株相比,gdpP缺失株共有214個基因的轉錄水平發(fā)生兩倍以上變化,其中105個基因的轉錄水平上調(diào),109個基因的轉錄水平下調(diào)。發(fā)生變化的基因涉及物質(zhì)代謝和轉運、蛋白質(zhì)合成與修飾以及毒力等幾大類,表明在SS2中c-di-AMP是一類參與全局調(diào)控功能的第二信使分子。為了進一步闡明c-di-AMP在SS2中發(fā)揮作用的具體機制,挖掘SS2中c-diAMP的結合蛋白非常關鍵。分別以枯草芽孢桿菌中具有c-di-AMP結合活性的cdi-AMP合成蛋白DisA和牛血清蛋白(BSA)作為陽性和陰性對照,建立了基于2'-AHC-c-di-AMP-agarose的分離c-di-AMP結合蛋白的方法,并采用該方法初步篩選了SS2 HA9801超聲破碎菌體中可與c-di-AMP結合的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測,共分離出11個清晰的蛋白帶,將蛋白酶解后,采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)技術分析序列,并經(jīng)NCBI Mascot database檢索,完成了相應蛋白的功能注釋,為深入研究c-di-AMP在SS2中發(fā)揮作用的具體機制奠定了基礎。綜上所述,本論文首次發(fā)現(xiàn)SS2存在c-di-AMP代謝相關基因,可調(diào)控c-diAMP的合成與分解。其中c-di-AMP分解蛋白基因gdpP的缺失對豬鏈球菌2型的多種生物表型、毒力以及代謝相關基因組轉錄具有顯著影響,提示c-di-AMP在SS2致病過程中發(fā)揮著全局性的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.611

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本文編號：2081761