本文選題：禽呼腸孤病毒 + p17　； 參考：《揚州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：禽呼腸孤病毒(avian reovirus, ARV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus),是禽類重要的病原體。病毒基因組是由10個節(jié)段的雙鏈RNA組成,可分為大(L)、中(M)、小(S)3組,主要編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中,p17蛋白是由ARV S1基因第二個開放閱讀框編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白,包含146個氨基酸,大小約為17 kD。由先前的研究可知,p17是細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭蛋白,其C端有核輸入信號。而p17在核質(zhì)中的分配與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān),且出核并不依賴于CRM1蛋白。p17可以通過PTEN、AMPK和PKR/eIF2a信號通路正調(diào)控細(xì)胞自噬,并增強(qiáng)病毒的復(fù)制。在調(diào)控細(xì)胞周期和宿主細(xì)胞翻譯方面,p17蛋白可以通過激活p53通路來阻礙細(xì)胞的生長。因此,p17蛋白是一種多功能病毒蛋白,它在調(diào)控細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期以及蛋白翻譯方面都起著重要的作用。盡管如此,目前對p17蛋白功能的研究仍然還存在許多未知的地方。本研究通過鑒定p17蛋白的核輸入信號與核輸出信號,并突變p17蛋白核輸入信號相關(guān)的功能氨基酸位點后,探究p17蛋白的細(xì)胞定位對其誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的影響以及對病毒復(fù)制的影響。1.禽呼腸孤病毒p17蛋白核輸入信號與核輸出信號的鑒定本研究首先將p17蛋白基因插入真核表達(dá)載體pEGFP-C1中,在宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白GFP-p17,建立了綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞定位的方法。所得結(jié)果也與文獻(xiàn)報道中的p17蛋白定位一致,也于ARV感染后的間接免疫熒光實驗一致,說明本方法可以用于p17蛋白定位的研究。同時,選取轉(zhuǎn)染pEGFP-p17后的不同時間點(9h、18 h、24 h、36h、48 h),觀察p17蛋白在細(xì)胞中的分布情況。此外,也與p10、σNS另兩個S基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白的定位進(jìn)行了比較,結(jié)果也與p17蛋白在細(xì)胞中的定位不同。為鑒定p17的核輸入信號,參考文獻(xiàn)中報道的序列,并將該序列中以及周圍存在的幾個連續(xù)的堿性氨基酸進(jìn)行突變,觀察p17突變體的細(xì)胞定位情況。發(fā)現(xiàn)突變p17蛋白C端的第122和123位的氨基酸后,可使p17蛋白的核定位發(fā)生改變,觀察到大部分熒光進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,從而確定這兩個氨基酸在p17蛋白的核定位中發(fā)揮著重要的作用。此外,p17是核質(zhì)穿梭蛋白,目前的研究僅知道p17蛋白可以出核,且出核途徑是CRM1蛋白非依賴的。本研究通過軟件預(yù)測與序列比對,在p17蛋白的序列中找到多個疑似核輸出信號的序列。將這些序列插入pEGFP-C1中進(jìn)行表達(dá)鑒定,根據(jù)觀察融合蛋白的表達(dá)情況后發(fā)現(xiàn),在p17蛋白的N端第19-26位有一段氨基酸片段能使細(xì)胞核中大量的GFP進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),并認(rèn)為它能夠介導(dǎo)p17蛋白的出核,且這種出核可能是通過CRM1以外的其他途徑。2.禽呼腸孤病毒p17蛋白核輸入信號的突變調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與病毒的復(fù)制已有研究證實,p17可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬,但是對于p17調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。本研究探討了p17核輸入信號對其引起細(xì)胞自噬及病毒復(fù)制的影響。為了研究p17蛋白的核定位與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的關(guān)系,構(gòu)建了突變p17第122位和第123位的氨基酸的重組真核表達(dá)載體。在Vero細(xì)胞和DF1細(xì)胞中,表達(dá)p17核輸入信號突變體短時間內(nèi)的自噬水平均顯著低于表達(dá)野生型p17的細(xì)胞。通過進(jìn)一步檢測p17入核對病毒增殖的影響,轉(zhuǎn)染野生型p17再感染ARV后的病毒復(fù)制水平顯著升高,說明p17可促進(jìn)細(xì)胞自噬的同時促進(jìn)病毒復(fù)制。而在感染病毒一定時間內(nèi),轉(zhuǎn)染細(xì)胞p17入核信號突變體并不能明顯的促進(jìn)病毒的復(fù)制水平,與轉(zhuǎn)染野生型p17的結(jié)果差異顯著。
[Abstract]:In this study , p17 protein is a kind of multifunctional viral protein , which is composed of 10 segments of double - stranded RNA . It can be divided into three groups : large ( L ) , medium ( M ) , small ( S ) 3 , which mainly encodes 10 structural proteins and 4 non - structural proteins . In order to investigate the effect of p17 protein on the proliferation of p17 protein , it was found that p17 could induce autophagy of p17 protein .
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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