本文選題：豬 + PD-1��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)是參與機體免疫負(fù)調(diào)控的重要分子,其配體為PD-L1和PD-L2。PD-1和PD-L1表達(dá)量升高引起機體免疫抑制或免疫功能損傷是多種病毒感染的重要致病機制。本實驗室前期研究表明,豬感染豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒后,誘導(dǎo)PD-1和PD-L1過表達(dá),激活PD-1/PD-L1通路,造成機體免疫功能損傷�？贵w阻斷PD-1/PD-L通路可以恢復(fù)或逆轉(zhuǎn)機體免疫力,因此,制備抗豬PD-1和PD-L1單克隆抗體,為阻斷豬PD-1/PD-L通路提供有效方法途徑。本研究的免疫原是表達(dá)純化的豬PD-1和PD-L1胞外區(qū)重組蛋白,BALB/c小鼠作為免疫動物,用細(xì)胞融合技術(shù)融合免疫BALB/c鼠脾細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0,用ELISA法多次篩選和克隆化,旨在篩選抗豬PD-1和PD-L1蛋白的單克隆抗體,并鑒定其生物學(xué)特性。研究結(jié)果顯示,2株單抗_(SW)PD1-2B5和_(SW)PDL1-3B5能分別特異性識別豬重組PD-1和PD-L1蛋白,抗體Ig亞型均為IgG1,PD-1雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價分別為1:1×212和1:2.048×105,PD-L1雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價分別為1:1×210和1:1.024×105。獲得的單克隆抗體_(SW)PD1-2B5和_(SW)PDL1-3B5能分別與相應(yīng)的重組豬PD-1和PD-L1蛋白反應(yīng),且都不與雞PD-1、Rosetta上清和pET-32a空載體蛋白反應(yīng),具有良好的特異性。連續(xù)3個月凍存、復(fù)蘇3次,2B5和3B5雜交瘤細(xì)胞株均能穩(wěn)定分泌抗體_(SW)PD1-2B5和_(SW)PDL1-3B5,培養(yǎng)細(xì)胞上清抗體效價分別為1:212和1:210。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明2株單抗能分別與豬PBMC有效結(jié)合。成功制備抗豬PD-1和PD-L1單克隆抗體,為在蛋白水平研究PD-1、PD-L1表達(dá)水平與疾病的關(guān)系以及應(yīng)用抗體阻斷PD-1/PD-L1通路在豬持續(xù)性病毒感染中的作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Programmed death-1 (PD-1) is an important molecule involved in the negative regulation of immune system. Its ligands PD-L1, PD-L2.PD-1 and PD-L1 increase the expression of PD-L1, PD-L2.PD-1 and PD-L1, which lead to immune suppression or damage of immune function, which is an important pathogenetic mechanism of multiple viral infections. Previous studies in our laboratory showed that pigs infected with porcine circovirus type 2 and swine fever virus induced PD-1 and PD-L1 overexpression and activated PD-1 / PD-L1 pathway, resulting in damage of immune function. Antibody blocking PD-1 / PD-L pathway can restore or reverse the immune system. Therefore, the preparation of monoclonal antibodies against porcine PD-1 and PD-L1 provides an effective way to block the PD-1 / PD-L pathway. The immunogen of this study was the purified porcine PD-1 and PD-L1 extracellular domain recombinant protein BALBP-c mice as immunized animals. The spleen cells and myeloma cells NS0 of BALBr / c mice were immunized by cell fusion technique and screened and cloned by Elisa. The aim of this study was to screen monoclonal antibodies against porcine PD-1 and PD-L1 proteins and to identify their biological characteristics. The results showed that McAbs _ (SW) PD1-2B5 and _ (SW) PDL1-3B5 could specifically identify porcine recombinant PD-1 and PD-L1 proteins respectively. The titers of the supernatant and ascitic fluid of IgG 1pPD-1 hybridoma cells were 1:1 脳 212 and 1: 2.048 脳 105 respectively, and the ascites titers were 1:1 脳 210 and 11.024 脳 105respectively. The obtained monoclonal antibodies _ (SW) PD1-2B5 and _ (SW) PDL1-3B5 reacted with the corresponding recombinant porcine PD-1 and PD-L1 proteins, respectively, and did not react with the chicken PD-1 Rosetta supernatant and pET-32a empty carrier protein. After cryopreservation for 3 months, the resuscitation of 2B5 and 3B5 hybridoma cell lines could stably secrete antibody _ (SW) PD1-2B5 and _ (SW) PDL1-3B5. The antibody titers of supernatant of cultured cells were 1: 212 and 1: 210, respectively. The results of flow cytometry showed that the two McAbs could bind to porcine PBMC effectively. Monoclonal antibodies against porcine PD-1 and PD-L1 were successfully prepared, which laid a foundation for studying the relationship between PD-1pPD-L1 expression level and disease at protein level and blocking PD-1 / PD-L1 pathway in porcine persistent virus infection.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

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本文編號：2064947