本文選題：雞 + 柔嫩艾美耳球蟲　； 參考：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：雞球蟲是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的病原體之一,導(dǎo)致養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失巨大。盡管飼料添加藥物的方式對球蟲病的防控發(fā)揮了重要的保障作用,但隨著雞球蟲抗藥性、藥物殘留等一系列問題的產(chǎn)生,迫切需要尋找新的藥物靶標(biāo)分子從而開發(fā)新型藥物。對瘧原蟲和弓形蟲等寄生原蟲的研究已經(jīng)表明,頂復(fù)門原蟲的頂膜抗原1(AMA1)是頗具應(yīng)用前景的藥物靶標(biāo)。瘧原蟲、弓形蟲等在侵入宿主細(xì)胞的過程中,AMA1發(fā)揮重要作用。但目前關(guān)于雞柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)子孢子頂膜抗原1(Et AMAl)的功能的相關(guān)報(bào)道較少。本研究探索了Et AMA1胞外域重組蛋白(Ecto AMA1)親和配體在球蟲感染中的抑制作用。1. 以純化并復(fù)性的原核重組Ecto AMA1蛋白為靶蛋白,利用噬菌體十二肽庫對其進(jìn)行四輪生物淘選。從第四輪洗脫物中隨機(jī)選出30個噬菌體藍(lán)斑,擴(kuò)增后提取其核苷酸序列并測序,進(jìn)而推導(dǎo)出多肽序列。結(jié)果顯示:對靶分子進(jìn)行四輪篩選后,得到5種親和力較高的十二肽。選取高親和力的兩條多肽序列進(jìn)行合成,命名為L肽和C肽,即為LPSYPGYYQITI(L)和CWTISLFGGVTQ(C)。間接ELISA結(jié)果表明,所合成兩多肽與重組Ecto AMA1蛋白及Et AMA1蛋白均能夠特異性結(jié)合。競爭ELISA結(jié)果表明,抗Ecto AMA1重組蛋白多克隆抗體能夠抑制親和噬菌體與重組Ecto AMA1的結(jié)合。2.對L肽和C肽體外抑制子孢子入侵細(xì)胞能力進(jìn)行評價。首先用MTT法檢測L、C兩多肽對MDBK細(xì)胞的最大無毒濃度,確定最大無毒濃度為125μg/m L。使用pecoll梯度離心法純化E.tenella子孢子,得到較為純凈的E.tenella子孢子,用CFDA-SE熒光探針標(biāo)記純化后的子孢子,利用標(biāo)記有綠色熒光的子孢子(3×10~5個/孔)入侵MDBK(鋪板量1×10~5個/孔)細(xì)胞10h,流式細(xì)胞儀檢測多肽L、C分別在濃度為25μg/m L、50μg/m L、75μg/m L、100μg/m L、125μg/m L時抑制子孢子入侵的作用。結(jié)果表明:L肽及C肽對子孢子入侵MDBK細(xì)胞均具有一定的抑制作用。在不同濃度梯度下L肽作用均顯著或極顯著高于C肽(P0.05或P0.01)。3.對L肽和C肽體內(nèi)抗球蟲感染作用進(jìn)行評價。1日齡雛雞40只隨機(jī)分為4組,每組10只,分別為PBS組、L肽處理組、C肽處理組以及攻蟲對照組。21日齡時,L組、C組、攻蟲對照組雞每只口服感染1×10~4個E.tenella卵囊,在感染后0~2天(子孢子繁殖期),L組口服L肽對應(yīng)陽性噬菌體,每只每天1×10~(12 )pfu;C組口服C肽對應(yīng)噬菌體,每只每天1×10~(12)pfu。攻蟲后第8天剖殺全部雞只,檢測雞增重變化、盲腸病變計(jì)分、盲腸眼觀病變及病理組織病變、OPG及ACI等評價指標(biāo)。結(jié)果顯示:L組、C組各項(xiàng)指標(biāo)均顯著優(yōu)于攻蟲對照組(P0.05),L組與C組相比,L組各項(xiàng)指標(biāo)均稍優(yōu)于C組。PBS組、L組、C組、攻蟲對照組抗球蟲指數(shù)分別為200、164.45、153.64、119.45。4.應(yīng)用Swiss-Model軟件對Et AMA1進(jìn)行三維模建。利用Autodock 4.2軟件分別對L肽與Et AMA1、C肽與Et AMA1進(jìn)行分子對接分析,研究Et AMA1在空間上與L肽和C肽結(jié)合方式。結(jié)果顯示:同源建模評分達(dá)90分以上,模型結(jié)果合理可靠。L肽、C肽的氨基酸與Et AMA1活性中心氨基酸間均存在分子間氫鍵作用力與疏水作用力,L、C肽在空間上均能夠與Ecto AMA1良好結(jié)合。綜上,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,篩選出的兩個Ecto AMA1重組蛋白親和配體可以與Et AMA1良好結(jié)合,能夠抑制E.tenella子孢子入侵宿主細(xì)胞并在抗球蟲感染中起到一定的保護(hù)作用。研究為基于Et AMA1的雞球蟲病相關(guān)多肽疫苗研制提供了參考。
[Abstract]:In this study , it is urgent to find new drug target molecules to develop new drugs . However , the study of parasitic protozoans such as Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii plays an important role in the invasion of host cells . The results showed that the maximal non - toxic concentration of L - peptide and C - peptide was higher than that of C - peptide ( P0.05 or P0.01 ) . The results showed that both the amino acids of the L - peptide , the C - peptide and the active central amino acid of Et _ ( 1 ) were able to bind to the same . The results showed that both the amino acids of the L - peptide , the C - peptide and the active central amino acids of Et _ ( 1 ) had a good binding effect .
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1968872