本文選題：抗繆勒氏管激素 + 卵母細(xì)胞成熟　； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：卵泡募集、發(fā)育及排卵是影響人和家畜繁殖力的關(guān)鍵因素,是生殖生物學(xué)和動(dòng)物繁殖學(xué)的重要研究領(lǐng)域。原始卵泡的生長(zhǎng)啟動(dòng)主要受卵巢自身自分泌、旁分泌因子調(diào)控,而抗繆勒氏管激素(AMH,anti-müllerian hormone)是目前已知唯一能抑制原始卵泡募集的內(nèi)分泌因子,被認(rèn)為是卵泡發(fā)育的調(diào)控閥。然而,AMH在卵巢中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制還不清楚,極大地限制了AMH在畜牧生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。本文通過(guò)免疫熒光檢測(cè)、RNA干擾、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、放射免疫測(cè)定、流式細(xì)胞術(shù)和數(shù)字芯片表達(dá)譜分析等手段,研究了AMH及其受體AMHR2在豬卵巢等組織的表達(dá),探討了AMH對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖和凋亡、類固醇產(chǎn)生、膜細(xì)胞類固醇產(chǎn)生、基因調(diào)控等方面的影響,分析了AMH在豬卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞體外發(fā)育中的調(diào)控作用及其機(jī)制。結(jié)果如下:試驗(yàn)一:AMH在豬卵巢及其它組織中的表達(dá)模式通過(guò)熒光定量PCR,發(fā)現(xiàn)豬AMH和AMHR2 mRNA均高表達(dá)于生殖器官睪丸和卵巢中,在其它組織器官中低表達(dá)或不表達(dá)。組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明,AMH在原始卵泡和初級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞中不表達(dá),在腔前和有腔卵泡顆粒細(xì)胞中表達(dá),高表達(dá)于卵丘顆粒細(xì)胞。熒光定量PCR結(jié)果顯示,當(dāng)卵泡直徑從1~3mm增加到3~5mm時(shí)顆粒細(xì)胞中AMH mRNA表達(dá)顯著下降(P0.05)。當(dāng)卵泡直徑從3~5mm到5mm時(shí),顆粒細(xì)胞中AMHR2 mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.05)。通過(guò)ELISA測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),1~3mm卵泡中AMH濃度顯著高于3~5mm和5mm卵泡中AMH濃度(P0.05),在5mm的卵泡中,AMH濃度幾乎無(wú)法測(cè)出。結(jié)果提示,AMH在豬卵巢及其它組織中的表達(dá)模式和其它物種相似。試驗(yàn)二:AMH對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響首先,以非限定性培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度AMH,用于培養(yǎng)豬卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs,Cumulus-oocyte-complexes),42±2h后發(fā)現(xiàn),各處理組在卵母細(xì)胞成熟率、卵丘擴(kuò)散指數(shù),孤雌激活后胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)上均無(wú)顯著差異(P0.05)。其次,以含PG600的化學(xué)限定培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,添加不同濃度AMH并用于COCs體外培養(yǎng),42±2h后發(fā)現(xiàn),10ng?m L AMH可顯著提高卵母細(xì)胞成熟率(P0.05),但不影響其卵丘擴(kuò)散指數(shù)和卵母細(xì)胞孤雌激活后的卵裂率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)(P0.05);卵母細(xì)胞體外受精后,10ng?m L AMH可以顯著提高體外受精胚的卵裂率(P0.05),但對(duì)囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)沒(méi)有影響(P0.05);卵母細(xì)胞成熟后,熒光定量PCR結(jié)果顯示,相對(duì)于對(duì)照組,10 ng?m L和100ng?m L的AMH添加組成熟卵母細(xì)胞中GDF9和BMP15 mRNA表達(dá)均無(wú)顯著變化(P0.05),且各組卵丘卵母細(xì)胞中CASPASE3和BAX mRNA均無(wú)顯著差異(P0.05),但10ng?m L和100ng?m L的AMH添加組BCL2 mRNA變動(dòng)顯著高于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)果表明,10 ng?m L AMH可促進(jìn)卵母細(xì)胞核和胞質(zhì)成熟。試驗(yàn)三:AMH在顆粒細(xì)胞中的調(diào)控作用體外培養(yǎng)期間,單獨(dú)添加AMH對(duì)顆粒細(xì)胞FSHR和CYP19A1 mRNA的表達(dá)及雌激素的產(chǎn)生無(wú)影響(P0.05),但FSH可以促進(jìn)FSHR和CYP19A1mRNA的表達(dá)和雌激素的產(chǎn)生(P0.05)。FSH和AMH共同添加時(shí),AMH可以顯著抑制FSH對(duì)FSHR和CYP19A1 mRNA表達(dá)和雌激素產(chǎn)生的促進(jìn)作用。對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行AMH si RNA干擾后,再以FSH處理培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞,其FSHR和CYP19A1 mRNA表達(dá)和雌激素產(chǎn)生均顯著升高(P0.05),但與未干擾AMH且添加FSH組無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)果說(shuō)明,AMH具有抑制FSH促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞類固醇激素產(chǎn)生和相關(guān)基因表達(dá)的功能。試驗(yàn)四:AMH對(duì)豬卵泡膜細(xì)胞類固醇激素產(chǎn)生的影響利用Procoll方法獲得高純度卵泡膜細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)卵泡膜細(xì)胞中有AMHR2 mRNA表達(dá)。LH處理卵泡膜細(xì)胞48h,可顯著提高卵泡膜細(xì)胞中類固醇合成的關(guān)鍵基因3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1和LH受體LHCGR mRNA的表達(dá)和雄烯二酮、孕酮的產(chǎn)生(P0.05)。AMH處理膜細(xì)胞對(duì)3β-HSD、CYP11A1、CYP17A1、LHCGR、STAR和CYP17A1 mRNA的表達(dá)和雄烯二酮、孕酮的產(chǎn)生均無(wú)顯著影響(P0.05)。LH和AMH共同處理卵泡膜細(xì)胞時(shí),顯著抑制LH誘導(dǎo)的3β-HSD、CYP11A1、、CYP17A1和LHCGR mRNA的高表達(dá)(P0.05),顯著降低雄烯二酮的產(chǎn)生(P0.05)。在AMHR2被si RNA干擾的卵泡膜細(xì)胞中,LH添加組與AMH/LH共同添加組中3β-HSD mRNA的表達(dá)無(wú)顯著差異(P0.05),表明AMH降低LH促進(jìn)3β-HSD mRNA表達(dá)的協(xié)同作用消失。si AMHR2干擾后,LH顯著促進(jìn)雄烯二酮和孕酮的產(chǎn)生(P0.05),而LH和AMH共同添加時(shí),雄烯二酮的產(chǎn)生顯著高于對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明AMH對(duì)LH的促進(jìn)的雄烯二酮分泌的抑制作用消失。結(jié)果提示,AMH在卵泡膜細(xì)胞中具有調(diào)控LH誘導(dǎo)類固醇產(chǎn)生的作用。試驗(yàn)五:AMH處理豬體外培養(yǎng)腔前卵泡基因表達(dá)譜分析為探索褪黑素影響豬卵泡發(fā)生的分子機(jī)制,對(duì)AMH處理18.5 d的PFsOGCs進(jìn)行數(shù)字芯片表達(dá)譜測(cè)序,通過(guò)差異基因表達(dá)分析,共篩選出159個(gè)上調(diào)基因和7個(gè)下調(diào)基因。qPCR驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致,說(shuō)明RNA-Seq數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。Gene Ontology顯著性富集分析結(jié)果顯示,AMH添加組的差異基因顯著性富集于代謝通路、TGFβ家族、ECM-receptor等相關(guān)通路。本研究表明,AMH在豬卵巢中的表達(dá)模式與其他物種相似。10ng/m L AMH對(duì)卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟有促進(jìn)作用,提高卵母細(xì)胞成熟效率和體外受精的卵裂率。在豬顆粒細(xì)胞中,AMH可以抑制FSH誘導(dǎo)的芳香化酶和雌激素的產(chǎn)生。首次發(fā)現(xiàn)通過(guò)其受體,AMH可以抑制LH誘導(dǎo)的卵泡膜細(xì)胞雄烯二酮的產(chǎn)生,說(shuō)明AMH在卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞均起到抑制類固醇產(chǎn)生的作用。AMH主要通過(guò)TGFβ通路、代謝通路和ECM-receptor通路調(diào)控基因。
[Abstract]:The expression of AMH and AMHR2 mRNA in the ovary and other tissues of porcine oocytes were studied by means of immunofluorescence assay , RNA interference , real - time fluorescence quantitative PCR , radioimmunoassay , flow cytometry and digital chip expression profiling . The results showed that AMH had no significant difference between the expression of FSHR and CYP19A1 mRNA and the production of estrogen ( P0.05 ) . The results showed that AMH could significantly increase the cleavage rate of FSHR and CYP19A1 mRNA and estrogen production ( P0.05 ) . The results showed that AMH could inhibit the production of testosterone induced by LH . The results showed that AMH could inhibit the production of testosterone and testosterone .
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：1937259