本文選題：抗繆勒管激素 + 豬　； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：抗繆勒氏管激素(anti-müllerian hormone,AMH)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor,TGF-β)超家族成員之一,由生長卵泡中的顆粒細胞分泌,能夠抑制原始卵泡的募集和降低生長卵泡對促卵泡素的敏感性,但其作用機制尚不清楚。豬是醫(yī)學試驗上理想的動物模型,為了深入探討AMH在對豬卵泡膜細胞在類固醇合成上的作用,開展了如下實驗:試驗一:AMH在豬上的表達模式本試驗主要采用RT-qPCR技術(shù),分析了AMH及AMHR在豬不同組織器官上以及在不同卵泡直徑上的表達規(guī)律;利用ELISA技術(shù),分析了在不同直徑卵泡液中AMH的表達規(guī)律。試驗結(jié)果表明:AMH及AMHR2在豬睪丸和卵巢中高表達,而在其它組織中不表達或表達量極低。顆粒細胞中AMH mRNA水平和卵泡中蛋白水平均呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大,AMH的表達量逐漸降低;在大卵泡(5mm)顆粒細胞中,AMHR2表達量最高(P0.05),而小卵泡及中卵泡(直徑1-5mm)的顆粒細胞中AMHR2的表達量最低,且無明顯差異(P0.05)。這說明,AMH及AMHR2的表達量與卵泡的生長發(fā)育階段有關(guān)。試驗二:豬卵巢卵泡膜細胞的分離純化和培養(yǎng)采用三種方法進行了豬卵泡膜細胞的優(yōu)化,方法A:注射針頭刮去顆粒細胞層,方法B:手術(shù)剪碎膜細胞層。A和B法均用IV型膠原酶消化后percoll密度梯度離心獲取44%和35%中間層為膜細胞,C法直接將膜細胞層用IV型膠原酶消化后采用兩次percoll梯度離心獲取卵泡膜細胞。利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三種蛋白的抗體進行細胞免疫熒光染色鑒定和流式細胞術(shù)鑒定細胞純度。結(jié)果表明:方法A獲得的膜細胞存活率及純度均顯著高于方法B和C(92.00%vs.80.33%,85.00%;95.77%vs.87.87%,90.87%)(P0.05);方法B獲得的細胞數(shù)顯著高于方法A和C(1.06×107vs.0.74×107,0.86×107)(P0.05),但耗時顯著低于方法A和C(236.67min vs.260.00min,268.33min)(P0.05)。結(jié)論:方法A可獲得較高膜細胞純度和細胞活力,本實驗為進一步研究膜細胞的功能提供了基礎(chǔ)。試驗三:AMH對卵泡膜細胞上類固醇激素合成酶的影響及機制研究FSH和AMH單獨或是共同添加于卵泡膜細胞中48 h后,通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn):在豬卵泡膜細胞中,FSH和AMH無論是單獨作用還是聯(lián)合作用,對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD的表達均無顯著影響(P0.05),但FSH或AMH單獨作用能夠顯著提高STAR mRNA的表達(P0.05),FSH和AMH共同作用對STAR mRNA的表達水平無顯著影響(P0.05)。這表明,FSH和AMH在促進類固醇合成起始過程中可能存在協(xié)同作用。LH和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細胞中48 h后,通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn):在豬卵泡膜細胞中,LH單獨作用能夠誘導LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達水平上調(diào)(P0.05);AMH單獨作用對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達水平無顯著影響(P0.05);LH和AMH聯(lián)合作用時,LHCGR、CYP17A1、3β-HSD mRNA表達水平與對照組及AMH單獨作用組均無顯著差異(P0.05),但顯著低于LH單獨作用組的水平(P0.05),而對STAR、CYP11A1 mRNA表達水平無顯著影響(P0.05)。Forskolin和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細胞中48h后,通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn),在豬卵泡膜細胞中,Forskolin能夠顯著上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA的水平(P0.05);Forskolin和AMH共同作用也可上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA表達水平,且與Forskolin單獨作用無顯著差異。這表明,在豬卵泡膜細胞上,AMH并不是以cAMP作為通路調(diào)控的。通過普通PCR發(fā)現(xiàn),豬卵泡膜細胞上存在AMHR2。在AMHR2被siRNA干擾的膜細胞中添加LH和AMH,通過Real-time qPCR發(fā)現(xiàn):LH能夠上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD mRNA水平(P0.05);但AMH對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSD m RNA水平無顯著影響(P0.05);LH和AMH共同作用時,LHCGR、CYP11A1和CYP17A1 mRNA表達水平均與對照組無顯著差異(P0.05),而3β-HSD mNRA表達水平顯著上調(diào)(P0.05)。這表明,AMH在卵泡膜細胞上是通過3β-HSD進而調(diào)控LH誘導的類固醇合成。綜上所述,本研究表明,AMH在豬上的表達模式與其它物種的相似,AMH及AMHR2的表達量與卵泡的生長發(fā)育階段有關(guān)。首次發(fā)現(xiàn),豬的卵泡膜細胞上表達AMHR2,并且AMH通過與AMHR2的結(jié)合能夠調(diào)控3β-HSD的表達進而調(diào)控LH誘導的類固醇合成。
[Abstract]:The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in porcine testis and ovary . The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in porcine testis and ovary . The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in porcine testis and ovary . The results showed that AMH and AMHR2 were highly expressed in different tissues of pigs . The results showed that AMH and AMHR2 were significantly higher than those of methods B and C ( 92.00 % vs . 80.33 % , 85.00 % ; 95.77 % vs . 87.87 % , 90.87 % ) ( P0.05 ) . There was no significant difference between the expression levels of LH and AMH ( P0.05 ) . The effects of LH and AMH alone or together on the levels of the mRNA expression in LHCGR , STAR , CYP11A1 , CYP17A1 and 3尾 - HSD were not significantly affected ( P0.05 ) . The results showed that AMH could up - regulate the levels of LHCGR , CYP11A1 , CYP17A1 and 3尾 - HSD mRNA ( P0.05 ) , but AMH could regulate the expression of LHCGR , STAR , CYP11A1 , CYP17A1 and 3尾 - HSD mRNA ( P0.05 ) .

【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S828

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本文編號：1778127