本文選題：雞 + 柔嫩艾美球球蟲��； 參考：《河北科技師范學院》2015年碩士論文

【摘要】：雞球蟲病是由一種或多種艾美耳屬球蟲寄生于雞的腸道不同部位所引起寄生原蟲病,尤以寄生于盲腸的柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)的致病力最強,極大地危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。微線蛋白2(Et MIC2)是由球蟲頂端微線體分泌的一種蛋白,它參與球蟲入侵的過程,能誘導雞體對E.tenella感染產(chǎn)生一定的免疫力。白細胞介素2(IL-2)為一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子,能增強DNA疫苗的免疫保護力和宿主免疫應答。將Et MIC2基因與IL-2基因串聯(lián)一起構建真核表達重組質(zhì)粒的研究還未見報道,因此本研究選擇E.tenella河北株Et MIC2基因與雞IL-2基因串聯(lián)到一起,連接到pc DNA3真核表達載體上,構建pc DNA3-Et MIC-2-IL-2真核表達載體,為今后柔嫩艾美耳球蟲DNA疫苗的研究提供了基礎。本研究主要分以下幾個部分:1.雞IL-2基因的克隆及生物信息學分析本研究根據(jù)Gen Bank中已登載的雞IL-2的m RNA基因序列,設計一對特異性引物,采用RT-PCR方法,成功克隆肉雞的IL-2基因,并對其序列測定、分析和生物信息學分析。測序結果表明:IL-2基因的CDS序列由432個核苷酸組成,編碼143個氨基酸,與Gen Bank中已經(jīng)登載的雞IL-2的氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn),僅在28、30、32和120位點的氨基酸發(fā)生了變異。序列分析結果表明,IL-2基因在不同雞品種間相對保守,而與哺乳動物的IL-2基因間卻存在種屬差異性。生物信息學分析表明:IL-2基因序列編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為16.429KD,理論等電點PI為5.66,分子式為C728H1178N184O225S10。該蛋白有較強親水性,含有蛋白跨膜區(qū)域,其信號肽的位置為前22個氨基酸,推斷該蛋白為跨膜分泌蛋白;二級結構中以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主,延伸鏈和β轉角只是在局部出現(xiàn);亞細胞定位顯示該蛋白主要在細胞膜上發(fā)揮作用。2.河北株Et MIC-2基因的克隆及生物信息學分析利用RT-PCR技術擴增出E.tenella河北株Et MIC-2基因,將該基因克隆入p MD-19T載體,進行測序、序列分析與生物信息學分析。測序結果顯示:河北株Et MIC-2基因的開放閱讀框(ORF)為1029bp,編碼342個氨基酸,與Gen Bank(AF111839.1)上發(fā)表的Et MIC-2核苷酸序列以及其編碼的氨基酸序列相似性分別為99.8%和99.4%,有2個堿基發(fā)生變異,(655位由堿基A變?yōu)镚、808位由堿基T變?yōu)镃)。序列分析結果表明:河北株Et MIC-2基因與E.tenella雜交株、北京株、廣東株、豪頓株Et MIC-2基因之間存在相對的保守性,而與布氏艾美耳球蟲MIC-2基因存在種屬差異性。生物信息學分析結果說明:河北株Et MIC-2基因序列編碼的蛋白質(zhì)相對分子量約為35KD,理論等電點PI為4.47,分子式為C1500H2429N431O528S5。該蛋白疏水性不強,沒有跨膜區(qū)域,其信號肽的位置可能為前22個氨基酸,推斷該蛋白為跨膜分泌蛋白;該蛋白的空間結構具有16個α螺旋,20個β折疊,17個轉角,25處無規(guī)則卷曲。3.pc DNA3-Et MIC-2-IL-2真核表達載體構建將克隆得到的河北株Et MIC-2基因、IL-2基因以及兩個基因融合的產(chǎn)物分別連接到pc DNA3真核表達載體,分別構建了pc DNA3-Et MIC-2、pc DNA3-IL-2和pc DNA3-Et MIC-2-IL-2 3個真核表達重組質(zhì)粒、經(jīng)雙酶切和測序驗證正確。其中在構建pc DNA3-Et MIC-2-IL-2重組質(zhì)粒時,在河北株Et MIC-2基因和雞IL-2基因之間加入了GGATCCTCCGCCACC基因連接臂,目的是為了確保2個基因在表達蛋白質(zhì)時能夠正確的折疊。將上述所構建的3種真核表達重組質(zhì)粒分別轉染293T細胞中進行表達,通過RT-PCR法成功檢測到了目的基因的表達。
[Abstract]:IL - 2 gene was cloned and sequenced . The results showed that IL - 2 gene was composed of 432 nucleotides , and its sequence was analyzed and bioinformatic . The results showed that IL - 2 gene was a kind of eukaryotic expression vector with immune regulation . The results showed that the relative molecular weight of Et MIC - 2 gene of Hebei strain was about 35KD , and the molecular formula was C1500H2429N431O528S5 . The results of bioinformatics analysis showed that the recombinant plasmid pDNA3 - Et MIC - 2 - IL - 2 had a molecular formula of C1500H2429N431O528S5 .

【學位授予單位】：河北科技師范學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7

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