發(fā)布時間：2018-04-13 17:36

  本文選題：布魯氏菌 + TCS　； 參考：《石河子大學》2017年碩士論文

【摘要】：布魯氏菌(Brucella)和人蒼白桿菌(O.anthropi)親緣關系很親密,都屬于Proteobacteria類的α-2亞類。但是致病能力卻相差很大,布魯氏菌是一種可引起人獸共患的強致病菌,能夠對全世界范圍內的公共衛(wèi)生安全造成嚴重的危害;而人蒼白桿菌是一種條件性致病菌,對人類的危害較小。二元調控系統(tǒng)(Two-component systems,TCS)是廣泛存在于細菌中的一類重要的毒力調控系統(tǒng),可以通過感應和處理環(huán)境信號來發(fā)揮其調控作用。該系統(tǒng)由組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK)和反應調控子(response-regulator protein,RR)組成。比較基因組學發(fā)現(xiàn),布魯氏菌和蒼白桿菌在基因組序列上差異較小,TCS是他們的主要差異之一。在蒼白桿菌中缺少布魯氏菌染色體II上的二元調控系統(tǒng)TceSR和TcfSR。先前研究表明位于染色體I上的12對TCS能夠調控布魯氏菌的能量代謝和轉運、生物大分子合成、細菌分裂以及細菌生存繁殖等與布魯氏菌毒力密切相關的基因,但位于染色體II上的的二元調控系統(tǒng)TceSR和TcfSR毒力表型和致病機制尚不清楚。本研究以突變株16M△TceSR和16M△TcfSR為研究對象,通過對其轉錄組測序和比較蛋白組研究的分析,揭示由二元調控系統(tǒng)TceSR和TcfSR調控的布魯氏菌的致病基因和致病性蛋白,為布魯氏菌的致病機制的研究和開發(fā)有效的治療藥物及疫苗奠定基礎。目的:本研究以羊種布魯氏菌親本株16M和突變株16M△TceSR和16M△TcfSR為研究對象,體外模擬巨噬細胞內的環(huán)境,找出TCS TceSR和TcfSR體外高效表達的條件,在此條件下培養(yǎng)親本株株16M和突變株16M△TceSR和16M△TcfSR,通過轉錄組學和比較蛋白組學研究深入探討TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌中的調控網(wǎng)絡及其與布魯氏菌致病性的關系,以期解釋TCS TceSR和TcfSR感受和處理環(huán)境信號后如何調控靶基因轉錄和靶蛋白的表達,從而促進布魯氏菌的生存。通過本實驗的研究為布魯氏菌的致病機制提供重要的信息。方法:(1)體外模擬細菌在巨噬細胞內的環(huán)境,先將親本株16M在TSB中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收菌重懸于高鹽、低p H、高溫、營養(yǎng)缺乏等環(huán)境壓力下刺激0.5h,收菌提RNA,反轉錄成c DNA。針對Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四個基因設計引物利用q RT-PCR技術確定最佳刺激條件。確定了最佳的刺激條件以后,將細菌在該條件下刺激不同的時間(0.5h、l.5h、3h、4.5h、6h),提取細菌RNA,反轉錄成c DNA后進行實時定量PCR檢測,確定最佳刺激時間。(2)在體外表達最佳條件中培養(yǎng)親本株16M和突變株16M△TceSR和16M△TcfSR,制備全菌樣品樣品。采用Label-free技術,并結合生物信息學分析,篩選出在缺失株和親本株中差異表達的蛋白,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌中的調控網(wǎng)絡與致病性的關系。(3)在體外表達最佳環(huán)境中培養(yǎng)親本株16M和缺失株16M△TceSR和16M△TcfSR,培養(yǎng)至最佳時間點時,收集菌體,提取RNA,采用RNA-seq技術,并結合生物信息學分析,篩選出在突變株和親本株中差異表達的基因,以期揭示TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌中的調控網(wǎng)絡與致病性的關系。結果:(1)通過體外模擬巨噬細胞內的環(huán)境,利用q RT-PCR方法確定了細胞在營養(yǎng)缺乏、p H值為4的情況下刺激3h時,Tce S、Tce R、Tcf S、Tcf R四個基因的表達量均是最高。因此將體外高效表達的條件確定為GEM4.0中刺激3h。(2)比較蛋白質組結果顯示:在親本株16M和突變株16M△TceSR中共有465個蛋白的表達發(fā)生了變化,差異表達倍數(shù)在2以上的有257個。在突變株16M△TceSR差異表達倍數(shù)在兩倍以上的下調蛋白共有147個,上調蛋白共110個。這些發(fā)生表達變化的蛋白主要是與碳氮代謝、二元調控系統(tǒng)、細胞分裂、熱休克蛋白、外膜蛋白、氧化磷酸化、ABC轉運子和轉錄相關的蛋白。在親本株16M和16M△TcfSR中共有137個蛋白的表達發(fā)生變化,在這些差異表達的蛋白中我們選取差異表達倍數(shù)兩倍以上的作為差異表達蛋白的研究對象,共86個,其中在突變株16M△TcfSR中表達上調的有44個,表達下調的有42個。這些差異表達的蛋白主要與布魯氏菌的代謝、氧化磷酸化、膜轉運、IV型分泌系統(tǒng)、轉錄和蛋白質運輸和RNA降解相關。(3)轉錄組結果顯示:在16M和16M△TceSR中的每個菌株中共檢測了3121個基因,與16M相比,在16M△TceSR中共有331個基因的表達發(fā)生了顯著的變化,其中有137個基因在突變株中顯著的下降,194個基因的表達發(fā)生了上調(p0.05)。在這些差異表達的基因主要涉及二元調控系統(tǒng),碳氮代謝、氧化磷酸化、ABC轉運系統(tǒng)、核糖體合成相關基因、脂多糖和分泌系統(tǒng)等。在16M和16M△TcfSR中的每個菌株中共檢測了3117個基因,與16M相比,在16M△TcfSR中共有342個基因的表達發(fā)生了顯著的變化,其中有177個基因在突變株中顯著的下降,165個基因的表達發(fā)生了上調(p0.05)。在這些差異表達的基因主要涉及核糖體大小亞基組成相關的基因、碳代謝、氧化磷酸化、細菌分泌系統(tǒng)、脂肪酸合成、ABC轉運系統(tǒng)、氨基酸代謝、嘌呤、嘧啶代謝和DNA復制、修復以及RNA降解、TCS等。結論:(1)TCS TceSR和TcfSR體外高效表達的條件均為GEM4.0中刺激3h;(2)全菌蛋白label-free技術和轉錄組測序結果表明兩個缺失株和親本株相比,都有很多蛋白和基因的表達都發(fā)生了變化,說明TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌內均有有一個復雜的調控網(wǎng)絡,從而使布魯氏菌適應各種復雜的環(huán)境。通過本課題的研究,對TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌胞內生存中和其調控的的分子機制有一個初步的了解,為深入研究TCS TceSR和TcfSR與布魯氏菌胞的生存和致病性提供了重要線索。
[Abstract]:Two - component systems ( TceSR ) and 16M 鈻，

本文編號：1745538