本文選題：禽致病性大腸桿菌CEl29　切入點：Ⅵ型分泌系統(tǒng)　出處：《揚州大學》2015年碩士論文

【摘要】：禽大腸桿菌病(Avian Colibacillosis)是養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的傳染病之一,給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失,至今尚無有效的防治措施。禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic E.coli, APEC)分離株眾多,其詳細致病機理還有待深入研究,但是已經(jīng)證實眾多的毒力基因是其主要致病因子。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type VI secretion system, T6SS)是一種新型分泌系統(tǒng),Hcp管道是其主要結(jié)構(gòu),在細菌致病過程中扮演重要角色。本研究以Hcp主要亞單位hcp1和hcp2基因為切入點,探討其在APEC CE129菌株感染宿主過程中的病原性。試驗通過比對NCBI上hcp1、hcp2基因的已知序列,利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌(APEC)野生株CE129的Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)hcp1和hcp2基因進行敲除。首先各設(shè)計一對引物用于檢測實驗菌株APEC CE129是否含有hcp1和hcp2基因,引物分別與GeneBank中已知的hcp1和hcp2基因序列5’端同源。然后根據(jù)試驗菌株的hcp1和hcp2基因再各設(shè)計一對引物,其5’端分別與hcp1和hcp2基因序列兩側(cè)同源,而3’端則與質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性基因Cat同源,用于獲得帶氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物,純化后導入含有質(zhì)粒pKD46的APEC CE129菌株中,在Red重組酶Beta、Exo、Gam作用下,氯霉素抗性基因片段依靠兩側(cè)同源序列與細菌染色體的靶基因發(fā)生重組,將hcp1和hcp2基因置換下來,通過氯霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆,即完成一次重組。再電轉(zhuǎn)化導入編碼F1p重組酶的質(zhì)粒pCP20,通過對Cat兩側(cè)Flp位點的識別,消除抗性基因,即完成二次重組。最后通過PCR特異性檢測和測序結(jié)果,驗證缺失株CE129Δhcp1、CE129Δhcp2和CE129Δhcp1Δhcp2的成功構(gòu)建。體外競爭試驗結(jié)果表明,Δhcp1缺失株在與野生株的競爭中處于微弱劣勢,其毒力被輕度弱化。血清殺菌試驗結(jié)果顯示,相比野生株CE129,缺失株CE129 Δhcp1、CE129Δhcp2、CE129Δhcp1Δhcp1抵抗血清補體殺菌的能力分別下降32.7%、35.1%和50.6%(p0.01)。生物膜定性定量試驗結(jié)果表明,Δhcp2缺失株形成生物膜能力下降40%(p0.01),回補株上升至87%。DF1細胞黏附試驗結(jié)果表明,Δhcp2缺失株的黏附能力下降46%(p0.01),回補株上升至96%。雞胚體內(nèi)感染試驗結(jié)果顯示,Δhcpi和Δhcp2單缺失株在雞胚體內(nèi)的增殖水平約為野生株的’/3,Δhcp1Δhcp2雙缺失株約為野生株的1/2。Real Time PCR定量試驗結(jié)果顯示,hcp1和hcp2基因具有協(xié)同表達關(guān)系；相比野生株CE129,缺失株CE129Δhcp1對群體感應luxS、lsrR、pfs基因表達量分別下降29%、41%、33%(p0.05),hcp1回補株分別上升至85%、98%、96%,對抗血清存活因子ompA和iss基因表達量分別下調(diào)29%和24%(p0.05),回補株分別上升至109%和105%；缺失株CE129Δhcp2對菌毛fimA基因表達量下調(diào)47%(p0.01),hcp2回補株上升至88%,對黏附相關(guān)基因fimC和papC基因表達量分別下降60%和37%(p0.01),回補株分別上升至84%和96%,對抗血清存活因子ompA和iss基因表達量分別下調(diào)31%和41%(p0.05),回補株分別上升至109%和88%。綜上所述,CE129的hcp2基因在細菌黏附,生物膜形成和血清殺菌過程中扮演重要角色,而hcpl基因在細菌體外競爭,群體感應和抗補體存活方面發(fā)揮作用,證明了Hcp直接與間接的介導了APEC CE129對宿主的致病過程。
[Abstract]:Avian colibacillosis (Avian Colibacillosis) is one of the most serious infectious diseases of poultry, poultry industry has caused tremendous economic losses, there is no effective control measures of avian pathogenic Escherichia coli (Avian Pathogenic, E.coli, APEC) isolated from many details, detailed disease mechanism needs further research, but has confirmed the virulence gene many is the main pathogenic factor. The type VI secretion system (type VI secretion system, T6SS) is a new type Hcp secretion system of pipeline is the main structure, play an important role in bacterial pathogenesis. In this study, Hcp subunit Hcp1 and hcp2 genes as the breakthrough point, to explore its pathogenic host process in the APEC CE129 strain infection. Through the comparison test on NCBI Hcp1, a known sequence of hcp2 gene, using phage lambda Red homologous recombination system of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) strains CE129 The type VI secretion system (T6SS) Hcp1 and hcp2 gene knockout. The design of a first primer for detecting whether the experimental strain APEC CE129 containing Hcp1 and hcp2 genes, primers and GeneBank respectively in the known Hcp1 and hcp2 gene sequences of the 5 'end. Then according to the homologous Hcp1 and hcp2 genes and the design of a test. On the 5' end of primers, respectively with Hcp1 and hcp2 gene sequence homologous, and the 3 'end of chloramphenicol resistance gene Cat and plasmid pKD3 homologous for PCR products with chloramphenicol resistance gene, purified into APEC containing plasmid pKD46 CE129 strain in Red, Beta Exo, Gam recombinase, role next, chloramphenicol resistance gene fragment of target gene homologous sequences and rely on the bacterial chromosome recombination occurs, the Hcp1 and hcp2 gene replacement down by chloramphenicol resistant plate screening positive clones, namely complete a restructuring.. The plasmid pCP20 was transformed into F1p encoding the recombinant enzyme, through identification of Cat on both sides of the Flp locus and eliminate resistance genes, to complete the two reorganization. Finally, the specificity of PCR detection and sequencing results verified the mutant strain CE129 CE129 Delta Hcp1, Delta hcp2 and delta Hcp1 Delta CE129 hcp2 was successfully constructed. The test results show that in vitro competition Delta, Hcp1 mutant and wild-type strain in the competition in the weak disadvantage, its virulence was slightly weakened. Serum bactericidal test results show that, compared to the wild strain CE129 and mutant CE129 CE129 Delta Hcp1, Delta hcp2, Delta Hcp1 Delta Hcp1 resistance ability of CE129 serum complement sterilization were decreased by 32.7%, 35.1% and 50.6% (P0.01) the biofilm qualitative and quantitative test results show that a hcp2 mutant biofilm formation ability decreased by 40% (P0.01), covering the line up to 87%.DF1 cell adhesion test results show that the adhesion of delta hcp2 mutant decreased 46% (P0.01), covering the line up to 96%. chicken embryos infection experiments showed that the proliferation level of /3 in chicken embryos was about wild strains' Delta hcpi and delta hcp2 deletion mutant, Delta Hcp1 Delta hcp2 double mutant is about 1/2.Real Time PCR quantitative test results of wild strains, Hcp1 and hcp2 genes expression has a synergistic relationship; compared to the wild strain CE129. The mutant strain CE129 of quorumsensing Delta Hcp1 luxS, lsrR, PFS gene expression was decreased by 29%, 41%, 33% (P0.05), Hcp1 covering strains were increased to 85%, 98%, 96%, ompA and ISS against serum survival factor gene expression were reduced by 29% and 24% (P0.05), covering strains were increased between 109% and 105%; the mutant strain CE129 of delta hcp2 pili fimA gene expression (P0.01), 47% hcp2 strains covering up to 88%, on the adhesion of the gene expression of fimC and papC genes were decreased by 60% and 37% (P0.01), covering strains were increased to 84% and 96%, against the survival factor OMP serum A and ISS gene expression were reduced by 31% and 41% (P0.05), covering strains were increased to 109% and 88%. in CE129, hcp2 gene plays an important role in bacterial adhesion, biofilm formation and serum bactericidal process, while HCPL gene competition in bacteria in vitro, play a role in survival and anti complement quorumsensing. That Hcp directly or indirectly mediated by the pathogenic process of APEC CE129 on the host.

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：1729717