本文選題：奶山羊　切入點：乳腺組織　出處：《西北農林科技大學》2015年碩士論文

【摘要】：奶山羊(Capra hircus)是一種重要的經濟物種,且山羊乳的營養(yǎng)成分及吸收效率均高于牛乳,因此適宜人們飲用并成為現代乳制品行業(yè)的一個重要原材料,由于山羊乳的特點和乳腺組織中的脂質代謝密切相關,因此對其乳腺組織的發(fā)育,泌乳及乳脂代謝進行研究是極其必要的。然而目前針對山羊乳脂代謝的研究還較少,且大多都集中于基因功能的探究與分析,缺乏從轉錄后水平,如microRNAs(miRNAs)水平對其進行研究。近年來,隨著高通量測序技術以及生物信息學的發(fā)展,一系列的miRNAs被發(fā)掘并提交到miRBase中,然而,在miRBase 20.0數據庫(2013年6月)中,還沒有可以利用的山羊miRNAs序列,并且,在以往的研究中,由于沒有可利用的山羊基因組,因此山羊的solexa測序結果一般是與其近緣物種,如牛,綿羊等的基因組相比對,來獲得其miRNA轉錄組。在本研究中,通過將solexa測序結果與山羊的基因組進行比對,從而獲得了更加可靠的山羊泌乳期miRNA轉錄組;通過對山羊miRNAs序列及其在山羊基因組上的定位分析,從而了解了山羊miRNA轉錄組特征;通過篩選并驗證在不同泌乳時期差異表達的miRNAs,從而得到了一些可能對山羊乳腺發(fā)育,泌乳及乳脂代謝等具有重要的調控作用的miRNAs。主要結果如下:1、通過solexa測序技術,在山羊泌乳中期乳腺組織中共檢測到了24479196個原始序列讀數(raw data),經過一系列的質量過濾后,最終得到了21517296個clean reads,占raw data的87.9%。對clean reads進行長度分析后發(fā)現,clean reads的片段大小主要集中在21-23nt之間,且在22nt長度處具有最多的序列讀數。將clean reads中相同的序列合并成一個unique reads,并與miRBase 20.0數據庫中已注釋的哺乳動物的pre-miRNAs,mature miRNAs以及山羊的基因組進行比對,最終得到了1059個mature miRNAs和821個pre-miRNAs,其中成熟的miRNAs包括796個保守的mi RNAs以及263個新的miRNAs。2、對測序得到的1059個miRNAs進行首位堿基的偏好性分析,結果顯示miRNAs的首位堿基對U有強烈的傾向性,而對G則有一定的抗性。對796個保守的miRNAs進行序列分析,發(fā)現與已注釋的序列相比,山羊miRNAs序列大多在其3'端發(fā)生了變化,由此形成了多個miRNA變異體(isomiR),且山羊miRNA轉錄組中的大部分miRNAs都是以isomiR的形式存在的。3、將796個保守的miRNAs與mi RBase 20.0數據庫中的24種哺乳動物的miRNAs進行比對,結果發(fā)現與其他物種相比,山羊與牛具有相同miRNAs的數目最多,為404個,而山羊與綿羊具有同源miRNAs的數目則較少,僅為102個。4、將821個pre-miRNAs與山羊基因組的染色體序列進行比對,結果發(fā)現有796個pre-miRNAs可以比對到山羊的染色體序列上,對比對上的pre-miRNAs進行進一步的染色體密度分析,發(fā)現796個pre-miRNAs在山羊染色體上的分布密度在1.1-0.11/Mbp之間,其中9號染色體上pre-miRNA的密度最小,為0.11個/Mbp,而21號染色體上pre-miRNAs的密度最大,為1.1/Mbp。5、miRNAs在基因組上是成簇排列的,將基因間最大間距(maximum inter-distance,MID)分別定義為3Kb,5Kb,10Kb以及50Kb時對山羊的miRNA cluster進行統(tǒng)計,結果發(fā)現當MID為3Kb時,429個miRNAs形成了86個cluster;當MID為5Kb時,442個miRNAs形成了87個cluster;當MID為10Kb時,460個miRNAs可形成90個cluster;而當MID為50Kb時,501個miRNAs共形成了99個cluster。6、將種子序列完全相同的miRNAs定義為一個miRNA家族,對測序得到的1059個mi RNAs按其種子序列進行家族分析,結果發(fā)現,有479個miRNAs可以與其他miRNAs形成mi RNA家族,共形成了164個miRNA家族,其中最大的家族為包含有12個成員的let-7家族,而剩余的573個miRNAs由于不含有與其他miRNAs相同的種子序列,因此無法形成miRNA家族。7、通過對U2,18s rRNA,5s rRNA基因分別設計反轉錄及定量引物,并進行定量檢測和擴增產物的鑒定,最終確定5s rRNA為miRNA S-Poly(T)法定量檢測的內參。8、通過將本次測序結果與已報道的研究成果相比對,最終得到了37個在山羊乳腺組織不同泌乳時期差異表達的miRNAs,利用qPCR方法對這些miRNAs分別進行泌乳前期、泌乳盛期、泌乳中期以及干奶期的乳腺組織表達水平檢測,發(fā)現僅有miR-222_R+2在四個不同的泌乳時期內沒有明顯的表達差異,而其余的36個miRNAs均存在著顯著的差異表達。9、通過在山羊乳腺上皮細胞中過表達mi R-145,并對其進行油紅O染色和甘油三酯含量的檢測,發(fā)現其不僅能夠顯著增加細胞中脂滴的含量,而且能夠促進細胞內甘油三酯含量的積累。結論:完成山羊泌乳期miRNA轉錄組的鑒定及特征分析,并篩選及初步驗證了36個可能對山羊乳腺發(fā)育,泌乳及乳脂代謝等具有重要的調控作用的miRNAs。
[Abstract]:The results are as follows : 1 . The results are as follows : 1 . With the development of high - throughput sequencing and bioinformatic development , there are 24479196 miRNA transcriptions in goat ' s breast tissue . In recent years , with high - throughput sequencing and bioinformatic development , a series of miRNA transcriptions have been obtained . In comparison with other species , we found that the first base pair U has a strong tendency towards U and has a certain resistance to G . It is found that when MID is 5 Kb , the number of pre - miRNA in the goat is smallest , which is only 102 . 4 . When MID is 10 Kb , there are 99 clusters . In the case of MID being 10 Kb , the number of the two hundred and ninety - nine microRNAs is defined as a miRNA family , and the 1059 mi RNAs obtained by sequencing are family analyzed according to their seed sequence , and the results are found . It was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells of goat mammary gland , and it was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells , and it was found that only miR - 222 _ R + 2 was able to significantly increase the content of lipid droplets in the cells , and to find out that only miR - 222 _ R + 2 had important regulatory effects on mammary gland development , lactation and milk fat metabolism .

【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S827

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