本文選題：鹿結(jié)核病　切入點：野毒株　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：鹿結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性人畜共患病,該病程世界分布,嚴(yán)重威脅人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。隨著鹿養(yǎng)殖數(shù)量的不斷增加,飼養(yǎng)員因接觸病畜而感染結(jié)核的病例也逐年攀升,因此,控制鹿結(jié)核病的蔓延不但有助于降低養(yǎng)鹿業(yè)的經(jīng)濟損失,也降低了飼養(yǎng)員的患病風(fēng)險。目前,卡介苗(BCG)可以預(yù)防鹿結(jié)核病。動物接種BCG一段時間內(nèi)結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗結(jié)果呈假陽性,嚴(yán)重影響結(jié)核菌素的皮內(nèi)試驗檢測結(jié)果。RD1區(qū)和RD5區(qū)均在結(jié)核分枝桿菌中存在,在卡介苗中缺失。有資料證實RD5區(qū)的Rv3117基因能夠區(qū)分動物結(jié)核病是自然感染還是卡介苗免疫,且其敏感性和特異性均高于ESAT-6蛋白。本研究克隆、表達并純化了Rv3117蛋白,誘導(dǎo)表達了實驗室保存的RD-1區(qū)基因的重組表達質(zhì)粒并對其進行純化獲得Rv3117、Rv3872、Rv3873、Rv3874、Rv3875、Rv3878、Rv3874-3875和Rv3872-3874-3875蛋白。利用ELISA方法綜合評價各蛋白作為鹿結(jié)核病ELISA檢測方法的候選抗原的敏感性和特異性,篩選出最優(yōu)抗原Rv3872-3874-3875蛋白,建立一種能夠鑒別鹿結(jié)核病野毒株感染與卡介苗免疫的方法,從而降低鹿結(jié)核病ELISA檢測的假陽性。本研究主要包括以下幾方面內(nèi)容:(1)Rv3117基因的克隆與表達載體的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌H37Rv為模板,設(shè)計特異性引物,擴增只在結(jié)核分枝桿菌中存在,而在卡介苗中缺失的RD5區(qū)的基因Rv3117。將目的基因Rv3117與克隆載體pMD18-T連接,經(jīng)鑒定結(jié)果顯示已將Rv3117基因成功克隆至克隆載體上。將Rv3117基因片段連接至表達載體pGEX-4T-1上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,篩取陽性克隆。(2)結(jié)核分枝桿菌野毒株與卡介苗差異基因的誘導(dǎo)表達及純化對前期制備的pGEX-4T-1-Rv3117的菌種進行誘導(dǎo)表達,用Western blot方法檢驗其是否具有結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng)原性。大量誘導(dǎo)表達Rv3117蛋白和實驗室保存的結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)特異性基因的菌種。用親和層析的方法對其進行純化,并對純化結(jié)果進行SDS-PAGE分析。(3)鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接ELISA檢測方法最優(yōu)抗原的篩選本試驗制備兔人工感染結(jié)核分枝桿菌、卡介苗和副結(jié)核分枝桿菌的陽性血清,以差異基因蛋白為包被抗原,分別建立間接ELISA方法,比較各包被抗原建立的間接ELISA方法的重復(fù)性、敏感性和特異性。結(jié)果表明Rv3872-74-75蛋白具有較高的重復(fù)性、敏感性和特異性,可以區(qū)分野毒感染和卡介苗免疫,為后期建立鑒別鹿結(jié)核病野毒株與卡介苗免疫ELISA檢測方法做準(zhǔn)備。(4)鑒別鹿結(jié)核病野毒感染與卡介苗免疫間接ELISA方法的建立及初步應(yīng)用建立檢測鹿結(jié)核病的Rv3872-74-75-ELISA方法,并用PPD-ELISA作為對照。對采集的鹿血樣進行批量檢測,結(jié)果表明Rv3872-74-75-ELISA能夠鑒別鹿結(jié)核病的野毒感染與卡介苗免疫,從而降低了接種卡介苗引起的假陽性結(jié)果。本研究利用分子生物學(xué)的方法,成功克隆并誘導(dǎo)表達結(jié)核分枝桿菌的差異基因蛋白,通過ELISA方法比較各蛋白作為包被抗原的優(yōu)越性,最終確立Rv3872-74-75蛋白可作為包被抗原建立鑒別鹿結(jié)核病野毒株與卡介苗免疫ELISA檢測方法,為鹿結(jié)核病的血清學(xué)診斷奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.25

【共引文獻】

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1 程亮;生鮮牛奶中牛分支桿菌PCR檢測方法的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

2 武文君;Q熱貝氏柯克斯體間接ELISA檢測方法的建立[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 林嘉明;牛分枝桿菌MPB70-MPB64抗原在牛結(jié)核ELISA診斷中的應(yīng)用[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

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本文編號：1703924