本文選題：馬駑巴貝斯蟲　切入點(diǎn)：二溫式PCR　出處：《新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：馬駑巴貝斯蟲病病原為駑巴貝斯蟲,該病是一種經(jīng)由媒介蜱蟲傳播的嚴(yán)重影響馬屬動(dòng)物健康的血液原蟲病,被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告檢疫疫病,在我國(guó)該病被列為二類動(dòng)物疫病。該病呈全球性發(fā)生,患馬呈現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿,急性病例死亡,亞急性、慢性病例終身成為帶蟲宿主,造成本土馬與引進(jìn)馬互相感染、反復(fù)發(fā)病,給馬養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。目前尚無(wú)該病的有效治療藥物及疫苗,故研發(fā)新型檢測(cè)技術(shù)是有效的防控途徑,可及時(shí)檢測(cè)、監(jiān)控和綜合防治,有利于馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。(Ⅰ)根據(jù)GenBank中的駑巴貝斯蟲(Babesia caballi)Bc48基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,建立檢測(cè)駑巴貝斯蟲的二溫式PCR方法。該方法能夠特異地?cái)U(kuò)增155 bp的片段,與雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、馬泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲均無(wú)交叉反應(yīng),能檢測(cè)到的最低DNA拷貝數(shù)為5.17×102 copies/μL。應(yīng)用所建立的方法檢測(cè)了采集于和靜縣焉耆馬匹樣品(N=82),結(jié)果顯示,馬駑巴貝斯蟲感染率69.51%(57/82),與血液涂片檢查結(jié)果37.8%(31/82)相比,其檢出率更高。該二溫式PCR檢測(cè)方法具有較高的特異性和敏感性,可用于馬駑巴貝斯蟲的早期診斷。(Ⅱ)根據(jù)Bc48保守部分基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物和MGB熒光探針,建立了駑巴貝斯蟲病的MGB FQ-PCR檢測(cè)方法。對(duì)所建立的FQ-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行特異性、靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn),并分別用FQ-PCR檢測(cè)方法和普通PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比。結(jié)果顯示,該方法靈敏度高,最小檢出量為5.17×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,比常規(guī)PCR靈敏100倍;建立的FQ-PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的循環(huán)閾值與模板濃度具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9996,重復(fù)性好,組內(nèi)與組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)分別為0.7%和0.42%,均小于1%;該方法能特異性檢測(cè)駑巴貝斯蟲,而對(duì)馬泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲等病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性。用建立的MGB-FQ PCR和常規(guī)PCR分別對(duì)90份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),MGB-FQ PCR和常規(guī)PCR檢出率分別為53%和30%。本次建立的駑巴貝斯蟲病MGB-FQ PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好,可用于馬駑巴貝斯蟲病臨床樣品診斷、流行病學(xué)調(diào)查,將為蜱傳馬梨形蟲病的檢測(cè)提供新的方法。
[Abstract]:The pathogen of cabal Babes's disease is Babes caballi, a blood protozoan disease that is transmitted by ticks and seriously affects the health of equine animals. It is listed as a reported quarantine epidemic by the World Health Organization (WHO). The disease is classified as a second class animal disease in China. The disease occurs globally, with horses presenting with fever, anemia, jaundice, hemoglobinuria, acute death, subacute, chronic cases and life-long host of the parasite. As a result of mutual infection between local and imported horses, recurrent diseases have caused great losses to the horse breeding industry. At present, there are no effective drugs and vaccines for the treatment of the disease. Therefore, the development of new detection techniques is an effective way to prevent and control the disease and can be detected in a timely manner. Monitoring and integrated control are beneficial to the healthy development of horse industry. (I) A pair of specific primers were designed according to the caballi)Bc48 gene sequence of Babes caballi in GenBank. A two-temperature PCR method was established for the detection of Babes caballi. The method was able to amplify a 155bp fragment with no cross reaction with the double bud Babes worm, ringworm Taylor worm, Maltaire worm and Taylor serpentine. The lowest copy number of DNA detected was 5.17 脳 10 ~ 2 copies/ 渭 L. the results showed that the infection rate of Babes caballi was 69.511and 57 / 82, compared with the results of blood smear 37.8 / 82). This two-temperature PCR detection method has high specificity and sensitivity, and can be used in the early diagnosis of Babes caballi. (II) according to the conserved gene sequence of Bc48, specific primers and MGB fluorescent probes were designed and synthesized. A MGB FQ-PCR method was established for the detection of Babes caballi disease. The specificity, sensitivity and reproducibility of the established FQ-PCR detection method were tested, and the clinical samples were detected and compared by FQ-PCR detection method and common PCR method. The sensitivity of the method is high, the minimum detection amount is 5.17 脳 101copies/ 渭 L, and the sensitivity is 100 times higher than that of conventional PCR. The standard curve of FQ-PCR has a good linear relationship with the concentration of template, the correlation coefficient is 0.9996, and the reproducibility is good. The coefficients of variation of repeatability test were 0.7% and 0.42%, respectively, which were less than 1. The method could be used to detect Babes caballi specifically, but to MarTaylor's, Babes's double bud, Taylor's annulus. The detectable rates of MGB-FQ PCR and PCR in 90 clinical samples were 53% and 30%, respectively. The specificity of MGB-FQ PCR assay for Babes's caballi was strong. It has high sensitivity and good reproducibility. It can be used in the diagnosis and epidemiological investigation of caballi Babes's disease. It will provide a new method for the detection of tick-transmitted piridiasis.
【學(xué)位授予單位】：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.21

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本文編號(hào)：1690622