發(fā)布時間：2018-03-28 02:02

  本文選題：奶牛乳房炎　切入點：金黃色葡萄球菌　出處：《吉林大學》2015年碩士論文

【摘要】：奶牛乳房炎（Bovine Mastitis）是畜牧養(yǎng)殖業(yè)和食品安全危害較大的一種疾病，，給人們帶來了巨大的損失。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌之一。長期以來有效的治療手段是使用抗生素，但是近年來由于對抗生素不合理的使用，導致了多重耐藥菌株的出現(xiàn)，給乳房炎的有效治療帶來了極大的困難。而噬菌體的裂解酶可以特異的殺滅病原菌，并且對耐藥細菌同樣有效，很有潛力成為控制耐藥性細菌的有效藥物。本實驗室前期獲得了對金黃色葡萄球菌具有廣譜、高效裂解活性的噬菌體裂解酶LysGH15，并揭示了其三維結(jié)構(gòu)和分子作用機制。在前期的基礎(chǔ)之上，本研究通過利用噬菌體裂解酶LysGH15快速殺滅金黃色葡萄球菌的能力，對金黃色葡萄球菌引起的乳房炎模型進行治療研究，以探尋利用該裂解酶治療奶牛乳房炎的潛力。 首先，對金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15進行了表達條件和純化條件的優(yōu)化。表明在20℃低溫誘導6h可獲得最大表達量，經(jīng)150mM咪唑濃度的buffer洗脫液純化最終獲得了純度較高的裂解酶LysGH15，經(jīng)過濃縮后測定其濃度為7.18μg/μL。采用平板分析法和濁度遞減實驗對所獲得的裂解酶LysGH15進行體外活性的測定，表明在37℃條件下濃度為1.0μg/μL的LysGH15經(jīng)過12h在涂抹有ATCC49525菌株的LB固體培養(yǎng)基平板上形成明顯的抑菌環(huán)；在濁度遞減實驗中經(jīng)10min OD600從1.0下降到0.4。上述實驗均表明裂解酶LysGH15在體外具有明顯的殺菌活性。 利用金黃色葡萄球菌ATCC49525建立小鼠乳房炎感染模型。將21只泌乳一周左右的母鼠隨機分為空白對照組、PBS組和5個感染組，每組3只。對于空白對照組的母鼠不做任何處理；而PBS組則對母鼠的第4、5對乳腺灌注PBS；感染組對母鼠的第4、5對乳腺灌注105cfu/50μL的金黃色葡萄球菌ATCC49525，并且對5個感染組的母鼠分別經(jīng)過8h、12h、24h、48h、72h后處死。然后通過肉眼觀察臨床癥狀、病理解剖、制作病理切片對病理組織的變化進行分析、ELISA測定乳腺組織細胞因子TNF-α水平。結(jié)果表明，與陰性對照組和PBS組對比，感染金黃色葡萄球菌48h后母鼠乳腺有明顯的臨床癥狀，出現(xiàn)紅、腫、熱、痛的病理變化；乳腺組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，乳腺腺泡大量崩解，大量炎性細胞浸潤，間質(zhì)變寬模糊不清，炎癥反應明顯；促炎因子TNF-α的水平顯著升高。所有這些結(jié)果均表明小鼠乳房炎模型構(gòu)建成功。 應用濃度為1.0ug/μL的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15對小鼠乳房炎模型進行治療，結(jié)果表明小鼠在感染后1h給予裂解酶低劑量（10μL）進行治療，使乳腺內(nèi)的菌含量得到了顯著下降，乳腺組織內(nèi)的TNF-α、IL-6等炎性因子的水平也顯著降低，減少了腺泡內(nèi)的炎性因子的浸潤，并且有效的緩解炎癥反應；而感染后8h給予裂解酶高劑量（50μL）進行治療，同樣能起到顯著的治療效果。綜上，金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶LysGH15對金黃色葡萄球菌造成的小鼠乳房炎模型表現(xiàn)出良好的治療效果，這為后續(xù)奶牛乳房炎的防治奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Bovine Mastitis is one of the most important pathogens in livestock breeding and food safety . Staphylococcus aureus is one of the most important pathogens causing cow mastitis .

First , the expression condition and purification conditions were optimized for S . aureus phage lysate . The results showed that the maximum expression can be obtained at low temperature of 20 鈩

本文編號：1674241