本文選題：牛磺鵝去氧膽酸　切入點：NR8383細胞　出處：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文

【摘要】：�；蛆Z去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic Acid,TCDCA)作為膽汁酸(Bile Acid,BA)的主要活性成分之一,能夠通過多種信號轉(zhuǎn)導通路誘導細胞凋亡而發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用。本研究以NR8383大鼠肺泡巨噬細胞為研究對象,分別開展了TCDCA對NR8383細胞凋亡、NR8383細胞中PKC—JNK/P38—5 信號轉(zhuǎn)導通路以及NR8383細胞分泌IL-1 β和TNF-α的影響,旨在分析TCDCA對免疫細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)控機制,探討TCDCA調(diào)控免疫細胞凋亡對免疫細胞凋亡分泌細胞因子的影響,進而深入揭示TCDCA的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用與其調(diào)控免疫細胞凋亡之間的關(guān)系。具體研究內(nèi)容如下:(1)TCDCA對NR8383細胞凋亡的影響采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PCMV-TGR5真核表達載體轉(zhuǎn)染至低表達TGR5受體的NR8383細胞中;采用qPCR法檢測NR8383細胞中TGR5受體及相關(guān)凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的基因表達量;采用Western Blot法檢測NR8383細胞中TGR5受體蛋白表達量;采用流式細胞術(shù)檢測TCDCA作用后NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞凋亡率;采用ELISA法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中caspase-3和caspase-8活性的影響。結(jié)果顯示,TGR5受體能夠在NR8383細胞中高效表達,成功構(gòu)建了高表達TGR5受體的NR8383細胞(NR8383-TGR5細胞)。NR8383-TGR5細胞中TGR5的mRNA及蛋白表達量均極顯著性高于NR8383細胞(P0.01)。TCDCA作用后對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞凋亡率影響的研究結(jié)果顯示,與NR8383組相比,TCDCA(10 μM)可顯著性提高NR8383細胞的凋亡率(P0.05),TCDCA(100 μM)可極顯著性提高NR8383細胞的凋亡率(P0.01)。與 NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(10 uM,100 μM)可極顯著性提高 NR8383-TGR5細胞的凋亡率(P0.01)。TCDCA(10 μM,100 μM)作用后,NR8383-TGR5 細胞的凋亡率極顯著性高于NR8383細胞(P0.01)。TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中相關(guān)凋亡蛋白caspase-3和caspase-8表達量的影響研究結(jié)果顯示,與NR8383組及NR8383-TGR5組相比,TCDCA(1 μM,10 uM,100 μM)均可極顯著性提高 NR8383 細胞和 NR8383-TGR5細胞的 caspase-3 基因表達量(P0.01)。且 TCDCA(10 μM)和 TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5組的caspase-3 mRNA表達量分別極顯著性(P0.01)和顯著性(P0.05)高于NR8383組。與NR8383組相比,TCDCA(100μM)可極顯著提高 caspase-3 活性(P0.01),與 NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(10 μM,100 μM)可極顯著性提高 caspase-3 活性(P0.01),且 TCDCA(1 μM,10 μM,100μ M)作用后,NR8383-TGR5組的caspase-3活性極顯著性高于NR8383組(P0.01)。與NR8383組相比,TCDCA(100 μM)可極顯著性提高caspase-8的基因表達量(P0.01),與 NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(10 μM,100 μM)可極顯著性提高caspase-8基因表達量(P0.01),且TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5組的caspase-8基因表達量顯著性高于NR8383組(P0.05)。與NR8383組相比,TCDCA(100 μM)可極顯著性提高caspase-8活性(P0.01),與NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(1 μM)可顯著性(P0.05)而 TCDCA(100 μM)可極顯著性提高 caspase-8 活性(P0.01),且 TCDCA(1 μM)和 TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5組的caspase-8活性分別顯著性(P0.05)和極顯著性(P0.01)高于 NR8383 組。(2)TCDCA對NR8383細胞中PKC—JNK/P38—p53信號轉(zhuǎn)導通路的影響利用磷脂酶 C-β(Phospholipase C-β,PLC-β)特異性阻斷劑 U73122 研究了 TCDCA 對其下游因子蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)表達及活性的影響。采用qPCR法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中PKC基因表達量的影響;采用Western Blot 法檢測 TCDCA 對 NR8383 細胞及 NR8383-TGR5 細胞中 PKC 和 pPKC 蛋白表達量的影響。結(jié)果顯示,與NR8383組及NR8383-TGR5組相比,TCDCA(100μM)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的PKC mRNA表達量(P0.01),且TCDCA作用后NR8383-TGR5組的PKC基因表達量極顯著性高于NR8383組(P0.01),而U73122能極顯著性降低NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的PKC基因表達量(P0.01)。與 NR8383 組及 NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(100 μM)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的PKC和pPKC蛋白表達量(P0.01),而U73122能極顯著性降低NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的PKC和pPKC蛋白表達量(P0.01)。利用PKC特異性阻斷劑G6 6983研究了 TCDCA對其下游因子c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)和P38表達及活性的影響。采用qPCR法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中JNK和P38基因表達量的影響;采用Western Blot 法檢測 TCDCA 對 NR8383 細胞及 NR8383-TGR5 細胞中 JNK、pJNK、P38、pP38蛋白表達量的影響。結(jié)果顯示,與NR8383組及NR8383-TGR5組相比,TCDCA(100 μ M)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的JNK mRNA表達量(P0.01),而Go 6983能極顯著性降低NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的JNK 基因表達量(P0.01)。與 NR8383 組及 NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(100 μM)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的JNK和pJNK蛋白表達量(P0.01),且NR8383-TCR5組的JNK和pJNK蛋白表達量極顯著性低于NR8383組(P0.01)。Go 6983能極顯著性降低NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的JNK和PJNK蛋白表達量(P0.01)。TCDCA(100μM)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5 細胞的 P38 mRNA 表達量(P0.01),且 NR8383-TGR5 組的 P38 mRNA表達量極顯著性高于NR8383組(P0.01),而Go 6983能極顯著性降低NR8383細胞及 NR8383-TGR5 細胞的 P38 基因表達量(P0.01)。與 NR8383 組及 NR8383-TGR5組相比,TCDCA(100μM)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的P38和pP38蛋白表達量(P0.01),且NR8383-TGR5組的P38蛋白表達量極顯著性低于NR8383組(P0.01),而Go 6983能極顯著性降低NR8383細胞的P38蛋白表達量(P0.01)。分別利用JNK特異性阻斷劑SP600125和P38特異性阻斷劑SB203580,研究了TCDCA對其下游因子p53表達及活性的影響。采用qPCR法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中p53基因表達量的影響;采用Western Blot法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中p53和pp53蛋白表達量的影響。結(jié)果顯示,與NR8383組及NR8383-TGR5組相比,TCDCA(100 μ M)能極顯著性提高NR8383細胞及 NR8383-TGR5 細胞的p53 mRNA 表達量(P0.01),而 SP600125 和 SB203580 均能極顯著性抑制NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的p53 mRNA表達量(P0.01),且SP600125作用后NR8383-TGR5組的p53 mRNA表達量極顯著性低于NR8383組(P0.01)。與 NR8383 組及 NR8383-TGR5 組相比,TCDCA(100 μM)能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的p53和pp53蛋白表達量(P0.01),而SP600125能極顯著性降低NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的p53和pp53蛋白表達量(P0.01),且 TCDCA(100 μM)或 SP600125 作用后 NR8383-TGR5 組的 pp53 蛋白表達量均極顯著性高于NR8383組(P0.01)。SB203580能極顯著性降低NR8383細胞的P53和pp53蛋白表達量(P0.01),并極顯著性降低NR8383-TGR5細胞的p53蛋白表達量(P0.01),且SB203580作用后NR8383-TGR5組的p53和pp53蛋白表達量分別顯著性(P0.05)和極顯著性(P0.01)高于NR8383組。(3)TCDCA對NR8383細胞分泌IL-1β和TNF-α的影響采用qPCR法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中白介素-1 β(Interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)基因表達量的影響;采用ELISA法檢測TCDCA對NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中IL-1β和TNF-α蛋白表達量的影響。結(jié)果顯示,與NR8383組及NR8383-TGR5 組相比,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)能極顯著性提高 NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的IL-1β基因和蛋白表達量(P0.01)。與LPS對照組相比,100 μ M TCDCA能極顯著性降低LPS誘導的IL-1 β的基因和蛋白表達量(P0.01)。另外,SP600125 和 SB203580 作用后,與 NR8383 組和 NR8383-TGR5 組相比,IL-1β的基因及蛋白表達量極顯著性降低(P0.01)。與NR8383組及NR8383-TGR5組相比,LPS能極顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的TNF-α的基因和蛋白表達量(P0.01)。與LPS對照組相比,100 μM TCDCA能極顯著性降低LPS誘導的TNF-a的基因和蛋白表達量(P＜0.01)。另外,SP600125和SB203580作用后,與NR8383組和NR8383-TGR5組相比,TNF-α的基因及蛋白表達量極顯著性降低(P0.01)。通過本研究可主要得出以下結(jié)論:(1)TCDCA能顯著性提高NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞的凋亡率,且10μM和100 μ M濃度的TCDCA作用后,NR8383-TGR5細胞的凋亡率顯著性高于NR8383細胞的凋亡率;TCDCA能顯著性增加NR8383細胞及NR8383-TGR5細胞中caspase-3和caspase-8的表達及活性,且NR8383-TGR5細胞中caspase-3和caspase-8的表達及活性均顯著性高于NR8383細胞。因而提示,TCDCA提高NR8383細胞的凋亡率與其激活TGR5受體有關(guān);(2)TCDCA能通過TGR5受體介導JNK、pJNK、P38、pP38、p53、pp53的表達量顯著性升高,且在U73122、Go 6983、SP600125、SB203580作用后均能顯著性降低其相應(yīng)下游產(chǎn)物的表達量。由此表明,TCDCA誘導NR8383細胞凋亡與其激活TGR5受體介導的PKC—JNK/P38—p53信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān);(3)TCDCA能顯著性降低LPS誘導的NR8383細胞和NR8383-TGR5細胞中IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白表達量。此外,與NR8383組和NR8383-TGR5組相比,SP600125和SB203580作用后,IL-1β和TNF-α的基因及蛋白表達量極顯著性降低。這一結(jié)果提示,TCDCA能夠通過PKC—JNK/P38信號轉(zhuǎn)導通路抑制NR8383細胞對IL-1β和TNF-α的分泌。綜上所述,TCDCA提高NR8383細胞凋亡率,并抑制其分泌炎性細胞因子TNF-α和IL-1 β,與其激活TGR5受體介導的PKC—JNK/P38—p53細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

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本文編號：1668294