劉澤文1，袁芳艷1，田永祥1，周丹娜1，楊克禮1，段正贏1，，郭  銳1，羅碧毅2
（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢  430064；2.湖北省京山縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北 京山  431800）

 

摘要：為了確定不同纖毛抗原的豬大腸桿菌和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病的最小菌（毒）含量，用不同菌數(shù)的E.coli C83549（K88）、C83644（K99）和C83710（987P）菌株培養(yǎng)物對(duì)出生18～24 h的仔豬進(jìn)行攻毒，用不同毒素含量的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素分別對(duì)出生18～24 h的仔豬和家兔進(jìn)行攻毒。結(jié)果表明，引起仔豬發(fā)病的大腸桿菌三種菌株的最低含量均為150×108 CFU，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起1日齡仔豬和家兔發(fā)病的最低毒素含量分別75和80小鼠MLD。
關(guān)鍵詞：大腸桿菌；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；毒力試驗(yàn)
中圖分類號(hào)：Ｓ852.7                  文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ                 文章編號(hào)：1007－273X（２０１３）０3-0029-03仔豬紅痢和黃痢是新生仔豬最常見(jiàn)的兩種傳染病，主要發(fā)生于出生后1周內(nèi)的新生仔豬，發(fā)病急、死亡快，常常給養(yǎng)豬業(yè)造成非常巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。
    仔豬黃痢主要是由致病性大腸桿菌（EPEC）引起發(fā)病， EPEC不侵入上皮細(xì)胞，而是利用一種或多種菌毛粘附因子，如F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）或F41和F42吸附在新生仔豬小腸黏膜上繁殖并產(chǎn)生腸毒素。該病常發(fā)生于出生后1周以內(nèi)的仔豬，以1～3日齡最常見(jiàn)，7日齡以上很少發(fā)生，同窩仔豬發(fā)病率可達(dá)到90%以上，死亡率極高，甚至全窩死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來(lái)極大的危害。仔豬紅痢是由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的，該菌為革蘭氏陽(yáng)性有莢膜不運(yùn)動(dòng)的厭氧大桿菌，可產(chǎn)生致死毒素，引起仔豬的腸毒血癥，壞死性腸炎。該病主要侵害出生后3 d以內(nèi)仔豬，病程短促，有些在生后3 d內(nèi)全窩死亡，最急的臨床癥狀多不明顯，一發(fā)現(xiàn)癥狀即迅速死亡，發(fā)病率可達(dá)40%～50%，病死率可高達(dá)100%［2］。
    國(guó)內(nèi)外對(duì)于仔豬紅痢和黃痢的主要預(yù)防措施是進(jìn)行免疫接種。目前用于預(yù)防這兩種疾病的疫苗有仔豬紅痢氫氧化鋁膠滅活疫苗及大腸桿菌病油乳劑滅活疫苗和基因工程苗，這些疫苗均為單聯(lián)疫苗或多價(jià)苗，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中受到很大限制，鑒于此，本研究室開展了新生仔豬大腸桿菌病和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病二聯(lián)滅活疫苗的研究。在二聯(lián)疫苗效力試驗(yàn)中，為了準(zhǔn)確掌握動(dòng)物的攻毒劑量，保證疫苗的免疫效果，開展了仔豬大腸桿菌和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)仔豬的毒力以及C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)家兔的毒力研究，現(xiàn)報(bào)告如下。
1  材料和方法
1.1  菌種
   大腸桿菌制造和檢驗(yàn)用菌種為大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）菌株；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌制造和檢驗(yàn)用菌種為C59-2菌株，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
1.2  試驗(yàn)動(dòng)物
1.2.1  初生仔豬  經(jīng)間接血凝試驗(yàn)檢測(cè)其血清大腸桿菌K88、K99、987P纖毛抗體效價(jià)均不高于1∶8，經(jīng)血清中和試驗(yàn)檢測(cè)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素抗體陰性的未免疫健康初胎懷孕母豬所產(chǎn)18～24 h仔豬，由武漢金鷹牧業(yè)有限公司提供。
1.2.2  家兔  1.5～2.0 kg健康家兔購(gòu)自武漢市萬(wàn)千佳禾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。
1.3  大腸桿菌攻毒菌液的制備
   按3%～5%的接種劑量將大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）菌株接種Minca湯培養(yǎng)基，在36～37 ℃條件下培養(yǎng)7 h，收獲菌液，細(xì)菌計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)菌濃度為100×108 CFU/mL。1.4  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒毒素的制備
將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2菌株按1%～2%接種厭氣肉肝湯，培養(yǎng)16～18 h，收集菌液，離心，取上清，測(cè)定毒素液對(duì)小白鼠最小致死量（MLD）。調(diào)整毒素含量為100 MLD/mL。
1.5  大腸桿菌對(duì)仔豬的毒力測(cè)定
   分別用100×108 CFU、150×108 CFU、200×108 CFU、250×108 CFU的大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）口服攻毒出生18～24 h的仔豬5頭，根據(jù)每組仔豬發(fā)�。ǜ篂a和死亡）情況，確定各血清型大腸桿菌引起仔豬發(fā)病的最小的菌數(shù)含量。
1.6  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的毒力試驗(yàn)
1.6.1  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)家兔毒力試驗(yàn)  分別用60 MLD、65 MLD、70 MLD、75 MLD、80 MLD和85 MLD 靜脈注射1.5～2.0 kg家兔5只，觀察24 h家兔的死亡情況，確定毒素對(duì)家兔的最小發(fā)病劑量。
1.6.2  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)仔豬毒力試驗(yàn)  分別用60 MLD、65 MLD、70 MLD、75 MLD、80 MLD和85 MLD 靜脈注射 18～24 h仔豬5頭，觀察24 h仔豬的死亡情況，確定引起仔豬死亡的最小梭菌毒素含量。
2 結(jié)果與分析
2.1 大腸桿菌對(duì)仔豬的毒力測(cè)定結(jié)果
    用不同菌數(shù)的大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）培養(yǎng)物分別口服攻毒出生18～24 h仔豬，結(jié)果（表1）顯示每頭仔豬經(jīng)口灌服150×108CFU大腸桿菌，可引起仔豬100%發(fā)病，確定150×108CFU為大腸桿菌引起仔豬發(fā)病的最小劑量。

2.2  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素的毒力試驗(yàn)結(jié)果
2.2.1  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)家兔毒力試驗(yàn)結(jié)果  用不同劑量（小鼠MLD）的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素靜脈注射體重為1.5～2.0 kg健康家兔，每只注射80倍MLD可引起家兔100%死亡，確定C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起家兔發(fā)病死亡的最小毒素含量為80倍MLD（表2）。

2.2.2  C型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)仔豬毒力試驗(yàn)結(jié)果  用不同劑量（MLD）的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素靜脈注射出生18～24 h內(nèi)的新生仔豬，每頭注射75倍MLD可引起仔豬100%死亡，確定C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起仔豬發(fā)病死亡的最小毒素含量為75倍MLD。

3 小結(jié)與討論
   （1）新生仔豬紅�。ù竽c桿菌�。┖忘S�。óa(chǎn)氣莢膜梭菌�。┦切律胸i最常見(jiàn)的兩種腸道傳染病，主要引起出生后1周內(nèi)的新生仔豬腹瀉，由于發(fā)病急、死亡快，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此為了防止該病的發(fā)生，最好的辦法是制備疫苗對(duì)母豬進(jìn)行免疫接種，初生仔豬通過(guò)吸吮母乳來(lái)獲得被動(dòng)免疫［3］。我們用含K88、K99、987P纖毛抗原的大腸桿菌和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分別接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)、制備了仔豬大腸桿菌病、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病二聯(lián)滅活疫苗，為了檢驗(yàn)疫苗的效果，需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)，掌握好攻毒的劑量是影響疫苗效力的關(guān)鍵，因此，本研究對(duì)豬大腸桿菌和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒力開展了研究，由于疫苗的效力檢驗(yàn)中涉及用家兔替代本動(dòng)物做效力檢驗(yàn)，因此也進(jìn)行了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素對(duì)家兔的毒力試驗(yàn)。
    （2）大腸桿菌不同纖毛抗原菌株對(duì)18~24 h初生仔豬具有較強(qiáng)的致病性，其致病性的強(qiáng)弱與感染菌數(shù)有很大關(guān)系，研究結(jié)果表明，150×108 CFU的大腸桿菌K88、K99、987P菌株均可引起仔豬100%發(fā)病。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可引發(fā)仔豬紅痢，該型菌的主要致病毒素是α和β外毒素，對(duì)仔豬具有非常強(qiáng)的致死性，在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染治病的過(guò)程中，外毒素起著非常關(guān)鍵的作用［4］，研究表明，C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素引起初生仔豬100%死亡的劑量是75個(gè)小鼠MLD，80個(gè)小鼠MLD可引起家兔100%死亡。
參考文獻(xiàn)：
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［2］ 劉澤文，熊忠良，楊克禮，等．新生仔豬紅黃痢二聯(lián)滅活疫苗的研制與應(yīng)用Ⅰ—C型魏氏梭菌生物學(xué)特性研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（21）：9063－9064．
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［4］ 斯特勞 B E. 豬病學(xué)［M］.趙德明，張中秋，沈建忠，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000.

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