本文選題：牛1型腺病毒(BAdV1)　切入點(diǎn)：感染性克隆　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人5型腺病毒(HAdV5)目前已作為一種優(yōu)秀的載體廣泛用于基因治療和疫苗研究。但是由于人群中普遍存在的HAdV5載體免疫,HAdV5載體的應(yīng)用受到很大限制。為克服HAdV5存在的以上缺陷,目前主要通過兩個途徑來解決。一是從病毒改造或替代角度解決,包括HAdV5衣殼改造、使用HAdV稀有血清型、使用動物腺病毒等。二是通過黏膜途徑免疫,主要為口服和滴鼻免疫。在病毒改造或替代方面,由于動物腺病毒與人腺病毒之間沒有交叉免疫反應(yīng),因此可作為HAdV5的理想替代載體。在黏膜免疫途徑方面,考慮到滴鼻免疫被報(bào)道存在神經(jīng)毒性,口服免疫安全便捷,因此可用于口服的腺病毒疫苗載體近年來受到廣泛的關(guān)注。牛1型腺病毒(BAdV1)分離自健康牛腸道,與人腺病毒之間無血清交叉反應(yīng),同時(shí)在腸道具有高穩(wěn)定性,基于BAd V1的疫苗載體可同時(shí)從兩個途徑克服HAdV5載體應(yīng)用瓶頸。因此本研究首次嘗試構(gòu)建基于健康牛腸道1型腺病毒的載體系統(tǒng)——BAdV1感染性克隆,后續(xù)有望用于BAdV1的基因功能研究和基于BAd V1載體的基因治療和口服疫苗研究。本研究主要分為2部分:1.通過細(xì)菌同源重組構(gòu)建BAdV1感染性質(zhì)粒本研究首先根據(jù)BAdV1的基因序列合成含有I-SceI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的LITR和RITR,并分別和擴(kuò)增的BAdV1 E1及E4片段進(jìn)行overlap PCR獲得BAdV1的左右同源臂(LITR+E1和RITR+E4),隨后分別克隆到pUC18載體上經(jīng)測序表明成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pUC18-E1-E4。野生型BAdV1在VIDO DT1細(xì)胞上擴(kuò)增后,提取線狀病毒基因組。Afl II線性化的pUC18-E1-E4質(zhì)粒通過與提取的BAdV1基因組在大腸桿菌BJ5183中同源重組,經(jīng)限制性酶切圖譜分析表明成功構(gòu)建了在BAdV1全基因組引入I-SceI酶切位點(diǎn)的BAdV1感染性質(zhì)粒pUCBAdV1。2.重組病毒BAdV1在VIDO DT1細(xì)胞上的拯救環(huán)狀重組基因組pUCBAdV1轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)I-SceI內(nèi)切酶的VIDO DT1細(xì)胞后成功包裝并傳代了重組BAdV1。這也證實(shí)了VIDO DT1可以拯救并增殖BAdV1。此外,重組BAdV1和wtBAdV1在VIDO DT1細(xì)胞增殖能力相當(dāng)都能達(dá)到較高的滴度,表明本研究構(gòu)建的BAdV1的重組載體系統(tǒng)可為其將來載體疫苗的開發(fā)研究奠定了重要的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Human adenovirus type 5 (HAdV5) has been widely used as an excellent vector for gene therapy and vaccine research. However, the application of HAdV5 vector, which is widely used in the population, has been greatly restricted. In order to overcome the above defects of HAdV5, human adenovirus type 5 (HAdV5) has been widely used in gene therapy and vaccine research. At present there are two main ways to solve the problem. One is from the perspective of virus transformation or substitution, including the transformation of HAdV5 capsid, the use of rare serotypes of HAdV, the use of animal adenovirus, etc. The other is immunization through mucosal channels. Mainly oral and nasal immunization. In virus modification or substitution, because there is no cross immune reaction between animal adenovirus and human adenovirus, it can be used as the ideal alternative vector of HAdV5. In view of the reported neurotoxicity of nasal drip immunization and the safety and convenience of oral immunization, the vector of adenovirus vaccine which can be used in oral administration has attracted wide attention in recent years. Bovine adenovirus type 1 (BAdV1) is isolated from healthy bovine intestines, There is no serum cross reaction with human adenovirus and high stability in the intestine. The vaccine vector based on BAdV1 can overcome the bottleneck of HAdV5 vector application from two ways at the same time. Therefore, this study is the first attempt to construct the vector system of BAdV1 infectious clone based on healthy bovine enterotype 1 adenovirus. This study is mainly divided into two parts: 1. Construction of BAdV1 infectious plasmids by homologous recombination of bacteria. The first step of this study was to construct BAdV1 infectious plasmids based on BAdV1. Sequence synthesis of LITR and RITR containing I-SceI restriction endonuclease recognition site, and overlap PCR with amplified BAdV1 E1 and E4 fragments to obtain LITR E1 and RITR E4 of BAdV1, respectively, were cloned into pUC18 vector and sequenced. The shuttle plasmid pUC18-E1-E4was successfully constructed. The wild type BAdV1 was amplified on VIDO DT1 cells. The linearized pUC18-E1-E4 plasmid of linear virus genome. AflII was homologous recombined with the extracted BAdV1 genome in Escherichia coli BJ5183. Restriction endonuclease map analysis showed that the BAdV1 infectious plasmid pUCBAdV1.2was successfully constructed by introducing I-SceI restriction site into the whole BAdV1 genome. The recombinant virus BAdV1 was transfected into VIDO DT1 cells to express I-SceI endonuclease. VIDO DT1 cells were successfully packaged and subcultured into recombinant BAdV1.This also confirmed that VIDO DT1 could save and proliferate BAdV1.In addition, Both recombinant BAdV1 and wtBAdV1 could achieve high titers in VIDO DT1 cells, indicating that the recombinant vector system of BAdV1 constructed in this study could lay an important foundation for the development and study of vector vaccine in the future.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3

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本文編號：1607462