本文選題：喹賽多　切入點：生長發(fā)育　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：喹賽多是抗菌促生長作用較好的一種喹VA啉類藥物,其對動物機體的生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響,適合用于食品動物的養(yǎng)殖業(yè)。雖然目前已有大量關(guān)于喹賽多藥理學機制的研究,但是喹賽多促生長作用的分子機制仍然不是很清楚。前期已經(jīng)從喹賽多作用下基因的表達、蛋白和激素的分泌、表型的變化等方面進行了研究,但是由于生物體是一個復雜的體系,其生長受到很多因素的影響,為了更好的說明喹賽多促生長作用仍需從多方面進一步研究。表觀遺傳學變化主要是指遺傳物質(zhì)的修飾,如DNA的甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等,這些遺傳物質(zhì)的修飾可以通過影響基因的啟動來對基因的表達變化產(chǎn)生調(diào)控,進而對機體的生長、發(fā)育產(chǎn)生影響。那么喹賽多作用于細胞后是否可以引起機體表觀遺傳學變化?喹賽多是否可以通過影響表觀遺傳學變化進而影響機體的生長發(fā)育?答案是未知的,仍需進一步研究。在動物機體的生長發(fā)育過程中,內(nèi)分泌系統(tǒng)起著極其重要的作用,其中IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1)是機體正常生長發(fā)育不可缺少的物質(zhì),而肝臟不但是IGF-1的主要分泌器官,而且還是各種不同藥物與機體直接接觸及在體內(nèi)進行代謝的主要器官。為了進一步揭示喹賽多的促生長作用機理,本課題以重組生長激素(rGH)為對照藥,以基因IGF-1為切入點,以大鼠的肝細胞(BRL細胞)為實驗材料進行相應的表觀遺傳學實驗。1.喹賽多于BRL細胞時間和劑量的確定(篩選對細胞生長最有利的條件)本課題采用MTT法,以細胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶(SDH)的含量為指標,檢測藥物作用下細胞的活力,并結(jié)合細胞生長狀態(tài)和IGF-1 mRNA表達量來確定喹賽多和對照藥物rGH作用于BRL細胞的時間和劑量。實驗結(jié)果表明,1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/ml的rGH分別作用于BRL細胞4 h后細胞中SDH的含量相對較高,且細胞的生長狀況良好,基因IGF-1 mRNA表達水平上調(diào)明顯,且與生長相關(guān)的基因GHR mRNA表達水平和IGF-1R mRNA表達水平也上調(diào)明顯,對細胞生長發(fā)育有利,由此確定可以用1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/m L的rGH分別作用于BRL細胞4 h進行后續(xù)的實驗。2.喹賽多對BRL細胞內(nèi)DNA甲基化的影響用1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/mL的r GH(對照藥)分別作用于BRL細胞4h,發(fā)現(xiàn)喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細胞基因組DNA甲基化水平增加,不利于某些基因的表達,而且BRL細胞基因組DNA甲基化水平會隨著喹賽多劑量的增加而改變,不會隨著時間的改變而發(fā)生變化。用BSP法檢測基因IGF-1啟動子區(qū)域甲基化水平卻發(fā)現(xiàn)1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/m L的rGH分別作用于BRL細胞4 h后可以引起基因IGF-1啟動子區(qū)域大部分CpG位點甲基化水平降低,這一現(xiàn)象是有利于轉(zhuǎn)錄因子與基因IGF-1啟動子區(qū)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物,有利于基因IGF-1的轉(zhuǎn)錄,促使IGF-1 mRNA表達水平增加。通過RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)DNA甲基化水平的變化可能與DNA甲基化相關(guān)酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B有關(guān),可能是藥物通過影響DNA甲基化相關(guān)酶的變化進而影響細胞內(nèi)的DNA甲基化水平。3.喹賽多對BRL細胞內(nèi)組蛋白修飾(H3K4me3和H3K27ac)的影響細胞內(nèi)組蛋白H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平與基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān),對細胞的生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細胞內(nèi)H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平明顯降低,且在0~4 h內(nèi)隨著細胞與藥物接觸時間的增加,BRL細胞內(nèi)H3K4me3修飾和H3K27ac修飾水平逐漸降低,這一現(xiàn)象對某些基因的轉(zhuǎn)錄表達是不利的。通過ChIP-qPCR實驗發(fā)現(xiàn),喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細胞內(nèi)基因IGF-1啟動子區(qū)域H3K4me3修飾和H3K27ac修飾水平明顯增加,促進IGF-1 m RNA表達水平。而且研究發(fā)現(xiàn)這些組蛋白H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平的增減可能與H3K4me3修飾酶和H3K27ac修飾酶密切相關(guān)。4.喹賽多對BRL細胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響為了進一步觀察喹賽多和對照藥rGH作用于BRL細胞后對細胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,我們以細胞內(nèi)染色質(zhì)上組蛋白H3K4me3修飾和H3K27ac修飾為參照,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察喹賽多和對照藥物rGH對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),BRL細胞在喹賽多和對照藥物rGH作用下BRL細胞核中可見空間變小,染色質(zhì)之間的空隙變得更大。添加抑制劑5-氮雜-2脫氧胞嘧啶核苷后,與喹賽多處理組和rGH處理組相比,細胞中細胞核內(nèi)可見空間變大,細胞中染色質(zhì)之間的空隙變得更小。由此可以推測BRL細胞在喹賽多和rGH作用下染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,變得更加疏松,有利于轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成,可能更有利于基因(如基因IGF-1)的轉(zhuǎn)錄和表達。通過對研究結(jié)果進行分析,可知:第一,喹賽多和rGH都可能通過調(diào)控DNMTs影響細胞內(nèi)DNA甲基化程度,一方面,引起B(yǎng)RL細胞內(nèi)基因組DNA甲基化水平增加,抑制某些基因表達,另一方面,卻可以引起基因IGF-1啟動子區(qū)域大部分CpG位點甲基化水平降低,促進基因IGF-1 mRNA表達;第二,喹賽多和rGH都可能通過影響H3K4me3修飾酶和H3K27ac修飾酶,引起B(yǎng)RL細胞內(nèi)H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平在0~4 h逐漸降低,抑制某些基因的表達,但是卻可以引起基因IGF-1啟動子區(qū)域H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平明顯增加,促進基因IGF-1的轉(zhuǎn)錄;第三,BRL細胞在喹賽多和rGH作用下,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加疏松,有利于轉(zhuǎn)錄起始復合物的形成,可能更有利于基因(如基因IGF-1)的轉(zhuǎn)錄和表達。本研究首次從表觀遺傳學變化的多個方面,以rGH為對照藥,以細胞整體水平及單個基因IGF-1為切入點,探究喹賽多是否可以引起表觀遺傳學變化及這些表觀遺傳學變化與生長發(fā)育之間的關(guān)系,為進一步說明喹賽多的促生長作用機理提供理論依據(jù),而且本研究也為抗生素促生長作用的研究提供思路和參考。
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【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S859.79

【參考文獻】

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本文編號：1606869