本文選題：鵝　切入點：肥肝　出處：《揚州大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：microRNA(miRNA)是一類長約21-23nt的非編碼RNA分子,其對基因的后轉錄調控發(fā)揮重要作用。已有研究表明miRNA在人和小鼠肝臟脂肪代謝障礙中起著重要調控作用。鵝肝臟沉積脂肪能力很強但不會有明顯的病理癥狀,是研究肝臟脂類代謝很好的模型。本研究采用第二代高通量測序方法,檢測鵝肥肝形成中差異表達的miRNA,利用生物信息學方法預測miRNA的靶基因,同時結合前期轉錄組測序研究結果,構建miRNA與基因間調控網絡,篩選出可能起核心作用的miRNA和靶基因。然后從篩選結果中挑選部分重要miRNA和對應靶基因(miRNA-33和CROT基因),利用鵝原代肝細胞分離培養(yǎng)技術、熒光定量PCR技術、Western Blot等技術進行靶向關系驗證及調控機制研究,為進一步闡明鵝肥肝形成的分子機制奠定基礎。本研究的主要結果如下:1.朗德鵝填飼效果及小RNA測序質量:70日齡的朗德鵝在經過19天的填飼后,較對照組其體重和肝重均發(fā)生顯著的增長(P0.05)。其中,填飼組和對照組鵝體重分別為7.57 ±0.48 kg 以及 3.87 ±0.25 kg(n=6),肝重分別為 826.26 ± 182.26 g 和 80.63 ± 12.80 g,肝體比(肝重/體重)分別為10.86%和2.08%。同時,填飼組鵝肝臟的顏色也由正常的深紅色變?yōu)橹靖蔚湫偷狞S褐色,表明填飼后實驗鵝確實產生了明顯的脂肪肝。對送測樣本的RNA進行質量檢測表明,RNA的樣品濃度≥80ng/μL,RNA無降解,無污染,總體質量較高。2.鵝肥肝形成過程中差異miRNA分析及調控網絡構建:通過對鵝不同填飼階段(7天、14天和19天)填飼組和對照組的肝臟進行小RNA測序,并對原始數據進行過濾、拼接和注釋,最終獲得了 1163個有注釋信息的miRNA。在77日齡、84日齡、89日齡三個時間點比較填飼組和對照組不同階段肝臟miRNA表達的差異,結果在三個時間點分別篩選出30(17個填飼組上調)、48(36個填飼組上調)和151(114個填飼組上調)個差異表達的miRNA。結合前期轉錄組測序數據對差異miRNA進行靶基因預測,在77日齡、84日齡、89日齡三個時間點分別獲得234個、445個、845個預測靶基因,其中在填飼組上調的預測靶基因分別為156個、270個、211個。對獲得的預測靶基因進行KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn),起關鍵調控作用的顯著富集通路包括:碳水化合物、脂質和氨基酸代謝通路,細胞生長死亡通路,免疫系統(tǒng)通路等。以差異表達miRNA的靶基因預測結果為基礎,使用STRING數據庫預測靶基因的互作關系并構建miRNA與基因間的調控網絡。3.miRNA-33及其靶基因CROT的表達調控研究:本課題組在前期的工作中發(fā)現(xiàn)miRNA-33與脂肪代謝緊密相關,并通過實驗對其靶基因進行了初步的預測和研究,發(fā)現(xiàn)CROT基因為其可能的靶基因。本研究結果也發(fā)現(xiàn),miRNA-33在填飼的不同階段(尤其是填飼后期)均發(fā)生了表達量的上調。因此,本試驗對miRNA-33及其靶基因CROT的表達調控進行了進一步的研究。熒光定量PCR結果與小RNA測序結果相符,證實了 miRNA-33在填飼各階段肝臟中均顯著上調。此外,miRNA-33在腹脂和胸肌中其表達水平也受填飼的影響而顯著升高,表明miRNA確實與填飼引起的脂肪代謝變化相關。進一步研究發(fā)現(xiàn),miRNA-33的預測靶基因CROT基因在填飼各階段肝臟中的mRNA水平均顯著下調,且在19天填飼組中的蛋白表達水平也顯著下調,這與miRNA-33的表達趨勢正好相反,表明在鵝肥肝形成過程中miRNA-33可能參與CROT基因的表達調控。細胞實驗發(fā)現(xiàn),在鵝原代肝細胞中轉染miRNA-33 mimic和miRNA-33質粒后,CROT基因的mRNA表達受到了顯著抑制;而在鵝原代肝細胞中轉染miRNA-33 inhibitor之后,CROT基因的mRNA表達則顯著升高,表明CROT基因確實為miRNA-33的靶基因。使用脂肪肝形成相關因子(葡萄糖和胰島素)處理鵝原代肝細胞發(fā)現(xiàn),葡萄糖處理可以顯著抑制miRNA-33的表達并誘導CROT基因,而胰島素則可以顯著誘導miRNA-33的表達并抑制CROT基因的表達。該結果不僅進一步證實了 miRNA-33與CROT基因的靶向調控關系,而且說明填飼引起的鵝肝臟中發(fā)生的高胰島素血癥可能是導致miRNA-33表達上調的主要原因之一,繼而調控CROT基因,參與鵝肥肝的形成。
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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S835

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1 鄭云;鵝肥肝形成過程中差異表達miRNA篩選及miRNA-33的表達調控研究[D];揚州大學;2017年

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本文編號：1573625