發(fā)布時間：2018-01-30 22:53

  本文關鍵詞： 己烯雌酚 單克隆抗體 間接競爭ELISA試劑盒 試紙條 殘留　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：己烯雌酚(Diethylstilbestrol,DES)屬于非甾體雌激素,具有促進動物生長和提高動物瘦肉率等作用,曾經(jīng)被當作促生長劑普遍應用于畜禽生產(chǎn)中,因其對人類有很強的致畸、致癌等毒副作用,大多數(shù)國家和地區(qū)已明確規(guī)定禁止在畜牧養(yǎng)殖中使用DES。為了降低動物生產(chǎn)成本,不規(guī)范使用己烯雌酚的現(xiàn)象仍然存在。傳統(tǒng)的理化檢測技術雖然能夠監(jiān)測動物源性食品中的DES殘留,但其存在用時長、、程序繁瑣費用高等不足,因此急需建立一種迅速、簡便、靈敏、準確、成本低的分析方法。本研究應用已制備的免疫原DES-BSA和己烯雌酚單克隆抗體(DES McAb)制備了間接競爭ELISA(ci-ELISA)試劑盒(DES-Kit)和免疫膠體金標記快速檢測試紙條(DES-Strip),并用液相色譜法(HPLC)和氣-質聯(lián)用法(GC-MS)對DES-Kit和DES-Strip的性能進行驗證。1.在分析DES分子結構和免疫原性的基礎上,經(jīng)過一系列化學反應在DES苯環(huán)的羥基(-OH)位點上引入活性基團羧基(-COOH),合成具有半抗原結構特征的己烯雌酚-單-羧基丙基-醚(DES-MCPE),利用活性酯法使DES-MCPE與牛血清白蛋白(BSA)發(fā)生偶聯(lián),合成免疫原DES-BSA, DES-MCPE與雞卵清蛋白(OVA)偶聯(lián),制備包被抗原DES-OVA。利用紫外掃描(UV)和SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行初步鑒定,實驗結果顯示,DES-BSA紫外掃描圖的最大吸收峰發(fā)生偏移,DES-BSA的泳動率小于BSA,判定DES-BSA偶聯(lián)成功,并測得DES與BSA分子結合比為12.8：1。用免疫原DES-BSA免疫3只BALB/c小鼠,5次免疫后獲得了抗DES多克隆抗體(DES pAb),用間接ELISA檢測DES pAb的效價均大于1：1.0×104,用cz-ELISA檢測DESpAb的半數(shù)抑制濃度(IC50),其中測定結果最好的2號小鼠的IC50為18.221 μg/L,與己烷雌酚(HEX)和雙烯雌酚的(DIEN)交叉反應率(CR%)分別為8.09%、3.63%與其他競爭物沒有交叉反應(CR)。獲得了靈敏、特異、高效價的多克隆抗體。2.利用ELISA篩選細胞融合鼠,應用融合劑聚乙二醇(PEG4000)使SP2/0瘤細胞與免疫小鼠的脾細胞發(fā)生融合,生成的雜交瘤細胞進一步篩選、克隆和擴大培養(yǎng)后,采用體內(nèi)誘生腹水法生產(chǎn)己烯雌酚單克隆抗體(DES McAb),選取4株敏感性和選擇性均好的抗DES雜家瘤細胞：1B8 DES McAb、2 C4DES McAb、4 Al DES McAb、4 C7 DES McAb,其細胞上清效價分別為：1：2.56×102、1：4.0×102、1：1.2×102、1：8.0 × 102,腹水效價分別為：1：2.0×105、1：2.56×105、1：128×105、1：5.12×105,親和常數(shù)(Ka)分別為：3.38×109、9.27×109、2.30×109、1.87×1010 L/moL,單抗亞型分別為：]gG2a/κ、IgGl/κ、IgG2a/κ、IgG2a/K。ci-ELISA測定親和力最高的4C7株的IC50為0.49μg/L,與HEX和DIEN的CR%分別為7.66%、3.83%,與其他競爭物沒有CR。3.以DES McAb為基礎,優(yōu)化了ci-ELISA最佳實驗條件。DES-OVA的包被濃度為0.5μg/mL, DES McAb的工作濃度為1：6.4×104；酶標二抗(GaMIgG-HRP)的稀釋濃度為1：1×103；最佳包被條件為37℃,包被原DES-OVA孵育120min,37℃,5%的豬血清封閉60min；室溫條件下,顯色時間為TMB顯色液作用10min。繪制出的ci-ELISA DES-Kit的標準曲線顯示為典型的S型,與4參數(shù)logit曲線擬合相符,IC50為0.49ng/mL,檢測限為0.5 ng/mL;陰性的鯽魚肉、豬肉平均回收率分別為79.3%和81.63%,平均變異系數(shù)(CV)分別為9.28%、8.70%,平均批內(nèi)CV分別為9.7%、9.3%,平均批間CV分別為7.6%、7.0%,平均批內(nèi)CV和平均批間CV均小于10%；與HEX和DIEN的CR%分別為6.53%、3.42%,與其他競爭物沒有CR；在4℃、避光條件下,DES-Kit可存放6個月。4.建立了膠體金的制備條件：以檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)作為還原劑,1.0%的氯金酸與1.0%的Na3c6H5O7·2H2O最佳的作用劑量比為1mL:1.7 mL,金顆粒直徑為25 nm；膠體金標記DES McAb的最佳標記濃度為7.2 μg/ml。應用膠體金免疫層析試驗(GICA)原理和獲得的DES McAb制備DES-Strip, DES-Strip的標準曲線顯示為典型的S型,機讀檢測限為0.25 μg/L,目測檢測限為2.0μg/L,10min內(nèi)即可完成測定,與其類似物沒有CR,在4℃干燥條件下DES-Strip的保存期為9個月。5. HPLC的確證檢測顯示,DES-Kit與HPLC的差異為2.7%～4.3%,DES-Strip與HPLC的差異為1.5%-4.9%；GC-MS的確證檢測顯示,DES-Kit與GC-MS的差異為1.4%～4.1%,DES-Strip與GC-MS的差異為1.0%-4.6%,實驗結果表明,4種方法的測定結果無明顯差異,測定結果基本相同。
[Abstract]:A rapid , simple , sensitive , accurate and low cost method was used to detect DES - BSA and DES - BSA . The results showed that the IC50 of DES - OVA was 3.38 脳 109 , 9.27 脳 109 , 2.30 脳 109 , 1.87 脳 1010 L / moL , respectively . The average CV and CV were 9.28 % and 8.70 % , respectively . The average CV and CV were 7 . 6 % and 8 . 70 % , respectively . The mean CV and CV were 7 . 6 % , 3 . 42 % , respectively . By HPLC , the difference between DES - Kit and HPLC was 2.7 % ~ 4.3 % , the difference between DES - Strip and HPLC was 1.5 % - 4.9 % . The difference between DES - Kit and GC - MS was 1.4 % ~ 4.1 % , and the difference between DES - Strip and GC - MS was 1.0 % - 4.6 % .

【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.84

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4 李Y輛，

本文編號：1477452