本文關(guān)鍵詞： 褪黑素 精原干細胞 支持細胞 GDNF 繁殖季節(jié) 奶山羊　出處：《西北農(nóng)林科技大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：褪黑素是動物松果體分泌的一種吲哚類激素,其分泌受光照的調(diào)節(jié),光照時間長,強度高,分泌多;光照時間短,強度低,分泌少。在我國北方地區(qū),每年的秋冬季節(jié)為奶山羊的繁殖季節(jié),褪黑素的分泌量大,雄性山羊的精液品質(zhì)高。在本實驗中,我們采集了繁殖與非繁殖季節(jié)成年奶山羊的睪丸組織,組織切片HE染色發(fā)現(xiàn),繁殖季節(jié)奶山羊精子發(fā)生更加活躍,各級生精細胞數(shù)目較多,自我更新和增殖相關(guān)標記基因的表達水平較高。免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn),在精子發(fā)生的各級生精細胞中均存在褪黑素的受體,在繁殖季節(jié)其受體的表達水平高。這些結(jié)果表明雄性奶山羊存在季節(jié)性繁殖現(xiàn)象,且褪黑素可能參與引起季節(jié)性繁殖現(xiàn)象。研究認為,動物的繁殖行為主要是依靠下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控,而褪黑素在其中發(fā)揮重要作用,褪黑素可以直接或間接作用于下丘腦,垂體以及生殖細胞來調(diào)節(jié)相關(guān)激素的分泌以及精子發(fā)生和卵子發(fā)生。精原干細胞是存在于曲細精管基底膜的一類具有自我更新和分化為精子能力的細胞,是精子發(fā)生過程中的“起始細胞”,為了研究褪黑素是否通過精原干細胞來調(diào)節(jié)精子發(fā)生進而參與季節(jié)性繁殖的形成,本實驗在體外培養(yǎng)奶山羊精原干細胞,并用褪黑素予以干預,得到以下結(jié)果:1.采用Ⅳ型膠原酶和胰蛋白酶結(jié)合消化法分離奶山羊睪丸組織細胞,經(jīng)過差速貼壁法富集,利用奶山羊精原干細胞培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)獲得奶山羊精原干細胞克隆,克隆呈CD49f、GFRa1、PGP9.5陽性,堿性磷酸酶弱陽性,同時在mRNA和蛋白水平表達精原干細胞標記PLZF,說明培養(yǎng)體系適用于奶山羊精原干細胞的培養(yǎng)。2.通過對細胞活力和增殖相關(guān)標記檢測以及細胞克隆大小判斷,發(fā)現(xiàn)褪黑素可以促進奶山羊精原干細胞的增殖。對支持細胞標記檢測發(fā)現(xiàn),褪黑素也可以促進支持細胞的標記SOX9和GDNF的表達,對精原干細胞分化標記基因Stra8,Dazl、Kit和Sycp3檢測發(fā)現(xiàn),褪黑素抑制精原干細胞的分化。而利用CCK-8,MTT以及Brdu染色發(fā)現(xiàn),褪黑素對mGSCs-I-SB細胞的增殖沒有影響。3.Elisa檢測發(fā)現(xiàn),在體外培養(yǎng)奶山羊精原干細胞時,支持細胞可以產(chǎn)生GDNF來維持精原干細胞的增殖和自我更新。加入褪黑素以后,上清液中的GDNF含量明顯升高,這說明褪黑素可以刺激支持細胞產(chǎn)生GDNF,繼而促進奶山羊精原干細胞的增殖和自我更新。Western blotting實驗發(fā)現(xiàn),GDNF是通過激活AKT和ERK1/2的磷酸化水平進行增殖和自我更新,且以p-ERK1/2的激活為主,加入褪黑素以后磷酸化的水平更高,這進一步說明褪黑素是通過GDNF這條通路促進山羊精原干細胞的增殖。通過體外褪黑素對奶山羊精原干細胞的影響實驗,我們認為繁殖季節(jié)奶山羊體內(nèi)褪黑素生成較多,可以刺激支持細胞產(chǎn)生更多的GDNF,進而促進奶山羊精原干細胞的增殖和自我更新,以維持精原干細胞池的穩(wěn)定。精子發(fā)生的調(diào)節(jié)還有其他多種激素的參與,在它們共同作用下形成了短日照動物的季節(jié)性繁殖現(xiàn)象。
[Abstract]:In the northern part of China , it is found that melatonin may play an important role in the reproduction season of dairy goats , and melatonin may play an important role in the reproduction season . It was found that melatonin could stimulate the proliferation and self - renewal of spermatogonial stem cells in milk goat . After addition of melatonin , it was found that melatonin could stimulate the proliferation and self - renewal of spermatogonial stem cells .

【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S827

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本文編號：1471840