本文關(guān)鍵詞： 日本血吸蟲 胰島素樣多肽 真核表達 多克隆抗體 免疫共沉淀　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：日本血吸蟲是一種寄生于恒溫脊椎動物體內(nèi)的雌雄異體寄生性蠕蟲,由于其生活史的復雜性以及終末宿主的多樣性,使其導致的血吸蟲病防治困難,嚴重危害公眾的健康。胰島素樣多肽(Insulin-like peptide,ILP)在無脊椎動物中具有基礎(chǔ)且重要的功能。早期的研究中未鑒定到日本血吸蟲內(nèi)源性的ILP編碼基因,人們認為血吸蟲通過利用宿主的胰島素進行生長代謝的調(diào)節(jié)。但最近的研究表明,日本血吸蟲基因組中存在唯一的ILP編碼基因,同時也鑒定到了唯一的胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)。血吸蟲可以利用宿主胰島素,而自身又存在ILP,那么這一ILP具有什么功能?日本血吸蟲胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(Sj-IGFBP)與自身ILP和宿主胰島素的對應結(jié)合關(guān)系又如何?這些問題的研究對我們理解血吸蟲的胰島素信號利用機制及其與宿主互作機制具有重要意義,同時也為血吸蟲病的治療和預防提供新的思路。本研究對日本血吸蟲胰島素樣多肽(Sj-ILP)進行了克隆表達,并對其與Sj-IGFBP的相互作用關(guān)系進行了研究。主要取得以下結(jié)果:1、日本血吸蟲胰島素樣多肽基因的克隆與序列分析。根據(jù)日本血吸蟲基因組注釋信息,設(shè)計特異性引物,利用RT-PCR從日本血吸蟲成蟲mRNA中成功擴增出長度為588 bp的Sj-ILP基因,其CDS序列長度為393 bp,由131個氨基酸殘基構(gòu)成。理論分子質(zhì)量為15.53 ku,等電點為7.49。三級結(jié)構(gòu)預測顯示,Sj-ILP基因與人胰島素基因的空間結(jié)構(gòu)非常相似。2、Sj-ILP的酵母表達及組織定位�；诋叧嘟湍该艽a子的偏好性,對Sj-ILP編碼基因進行密碼子優(yōu)化,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPIC9K-Sj-ILP,并在畢赤酵母GS115中進行誘導表達。SDS-PAGE與Western-blot檢測結(jié)果顯示,重組蛋白Sj-ILP獲得高效表達,其大小約為15 ku,與預期結(jié)果一致。利用合成肽技術(shù),設(shè)計并合成得到兩條特異性的肽段,偶聯(lián)KLH,免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,間接ELISA檢測其抗體效價達到1:51200,Western-blot鑒定特異性多肽具有良好的免疫原性。免疫組化實驗結(jié)果表明,Sj-ILP蛋白在日本血吸蟲成蟲的基底膜和卵巢部位表達量相對其他部位較高,預測Sj-ILP可能與營養(yǎng)攝取及生殖發(fā)育有關(guān)。3、Sj-IGFBP與Sj-ILP、人胰島素(Human insulin,HI)的相互作用研究。分別構(gòu)建pCMV-HA-Sj-IGFBP與pCMV-myc-Sj-ILP、pCMV-myc-HI重組質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染CHO細胞。間接免疫熒光分析,三者均在CHO細胞中成功表達;免疫熒光共聚焦試驗表明,發(fā)綠色熒光的pCMV-HA-Sj-IGFBP可與發(fā)紅色熒光的pCMV-myc-Sj-ILP、pCMV-myc-HI共表達呈黃色熒光,可以共定位于細胞的同一層面;免疫共沉淀證實Sj-IGFBP可以沉淀Sj-ILP、HI,反之Sj-ILP、HI也可以沉淀Sj-IGFBP,表明它們之間存在潛在的相互作用。
[Abstract]:Schistosoma japonicum is a parasite on the temperature of vertebrates dioecious parasitic worms, because of the complexity of its life history and end host diversity, which leads to the difficulty of schistosomiasis control, serious harm to public health. Insulin like peptide (Insulin-like peptide ILP) is a fundamental and important function in marine invertebrates. Early studies have not identified the ILP gene encoding Schistosoma japonicum endogenous, people think that regulate the growth and metabolism of the host through the use of insulin. But recent studies show that ILP gene encoding only the genome of Schistosoma japonicum, also identified that the only insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) of Schistosoma japonicum can. The use of insulin and its host, and ILP, then this ILP has what function? Japanese blood sucking insect insulin-like growth factor Sub binding protein (Sj-IGFBP) combined with ILP and its relationship with the corresponding host insulin how? The study of these problems in our understanding of the mechanism of insulin signal by schistosome and has important significance and host interaction mechanism, but also provide new ideas for the prevention and treatment of schistosomiasis. The pre study on insulin like peptide of Schistosoma japonicum (Sj-ILP) were cloned, and its interaction with Sj-IGFBP were studied. The main results are as follows: 1. Cloning and sequence analysis of Schistosoma japonicum insulin-like polypeptide gene. According to Schistosoma genome annotation, specific primers were designed by RT-PCR mRNA from Schistosoma japonicum was successfully amplified by Sj-ILP the gene is 588 BP in length, the length of the CDS sequence was 393 BP, consists of 131 amino acids. The theoretical molecular weight of 15.53 Ku and an isoelectric point of 7.4 9. the three stage structure prediction showed that the spatial structure of Sj-ILP gene and human insulin gene is very similar to.2, yeast expression and tissue localization of Sj-ILP. Pichia pastoris codon bias based on codon optimization of Sj-ILP encoding gene, recombinant expression plasmid pPIC9K-Sj-ILP, and induced the expression of.SDS-PAGE and Western-blot results showed that Pichia pastoris GS115, recombinant protein Sj-ILP was expressed, its size is about 15 Ku, consistent with the expected results. By using the synthetic peptide technique, designed and synthesized two peptides, a specific coupling of KLH, New Zealand white rabbits were immunized to prepare polyclonal antibody, indirect ELISA to detect the antibody titer reached 1:51200 Western-blot, identification of specific peptide has good immunogenicity. The immunohistochemical results showed that the expression of Sj-ILP protein in the basement membrane of adult Schistosoma japonicum eggs and nest site The relative amount of other parts is high, may predict Sj-ILP and nutritional intake and reproductive development of.3, Sj-IGFBP and Sj-ILP, human insulin (Human insulin, HI). The interaction of pCMV-HA-Sj-IGFBP and pCMV-myc-Sj-ILP were constructed, pCMV-myc-HI recombinant plasmids were transfected into CHO cells. Indirect immunofluorescence analysis, three were successfully expressed in CHO cells show; confocal immunofluorescence test, pCMV-myc-Sj-ILP green fluorescence pCMV-HA-Sj-IGFBP with red fluorescence, yellow fluorescence co expression of pCMV-myc-HI, can set the same level in the cell; confirmed that Sj-IGFBP can precipitate Sj-ILP, CO immunoprecipitation and HI, Sj-ILP, HI can also precipitate Sj-IGFBP, indicate the existence of potential interactions between them.

【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.7

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