本文關(guān)鍵詞：3型鴨甲肝病毒快速檢測(cè)方法及對(duì)青年鴨侵染規(guī)律研究　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：本文對(duì)3型鴨甲肝病毒(DHAV-3)的細(xì)胞適應(yīng)和增殖規(guī)律、快速檢測(cè)方法及DHAV-3對(duì)青年鴨侵染規(guī)律進(jìn)行了研究,獲如下結(jié)果：1、DHAV-3的細(xì)胞適應(yīng)和增殖規(guī)律DHAV-3在鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)盲傳至第4代、在鴨胚肝細(xì)胞(DELC)盲傳至第3代可出現(xiàn)細(xì)胞病變。DHAV-3接種DEF后4 h,定量PCR (qPCR)即可檢測(cè)到DHAV-3,隨著時(shí)間推移其拷貝數(shù)不斷增加,到72 h時(shí)達(dá)到最大值(10~(5.76) copies/μL); DHAV-3接種DEF后4h, TCID_(50)即可檢測(cè)到DHAV-3,隨著時(shí)間推移其滴度不斷增加,到72 h時(shí)達(dá)到最大值(10~(4.42)/100μL)。DHAV-3接種DELC后4 h,定量PCR (qPCR)即可檢測(cè)到IDHAV-3,隨著時(shí)間推移其拷貝數(shù)不斷增加,到60 h時(shí)達(dá)到最大值(10~(7.14)copies/μL); DHAV-3接種DELC后4h,TCID_(50)即可檢測(cè)到DHAV-3,隨著時(shí)間推移其滴度不斷增加,到60 h時(shí)達(dá)到最大值(10~(5.75)/100μL). DEF和DELC上清中的DHAV-3的含量低于細(xì)胞中的含量。2、SYBR Green I quantitative PCR (qPCR)檢測(cè)DHAV-3方法建立根據(jù)DHAV-3的VP3基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,建立了SYBR Green I quantitative PCR (qPCR)檢測(cè)方法,其標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-3.317X+36.434,模板濃度在10~2-10~8 copies/μL之間其相關(guān)系數(shù)為0.996;熔解曲線(xiàn)為單一峰,其它被檢測(cè)的病原(DHAV-1、 DPV、大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、鴨疫里氏桿菌)結(jié)果為陰性,最低檢測(cè)限度為102 copies/μL,具有良好特異性和敏感性。用qPCR和TCID_(50)兩種方法分別測(cè)定DHAV-3在DELC和DEF中的增殖規(guī)律,結(jié)果表明DHAV-3在DELC和DEF中的增殖趨勢(shì)一致。3、Real time RT-LAMP檢測(cè)DHAV-3方法建立根據(jù)DHAV-3的VP3基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物,建立了real time RT-LAMP檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)其它病原(DHAV-1、DPV、鴨疫里默氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌、大腸桿菌)結(jié)果為陰性,最低檢測(cè)限度為104 copies/μL,具有良好特異性和敏感性。RT-LAMP可以定性和定量檢測(cè)DHAV-3.4、DHAV-3在人工感染青年鴨體內(nèi)的增殖、分布、排泄規(guī)律60只2月齡青年鴨,其中55只肌肉注射含DHAV-3 (10~(15) copies/只)鴨胚尿囊液進(jìn)行人工感染,于感染后1d、2d、4d、7d、14d、21d、28d、42d、56d、70d,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取5只鴨采血后剖殺,采集呼吸器官、免疫器官、消化器官及腸道內(nèi)容物等,用qRT-PCR檢測(cè)組織與內(nèi)容物中DHAV-3的拷貝數(shù)。設(shè)置空白對(duì)照鴨5只,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血檢測(cè)DHAV-3。結(jié)果如下：(1)增殖規(guī)律：接毒1d-56d, DHAV-3在肝臟中的拷貝數(shù)呈現(xiàn)不斷上升地趨勢(shì),到56d病毒含量最大,0.1 g肝臟中的DHAV-3拷貝數(shù)為10~(941) copies,是感染鴨病毒含量最高的器官。(2)分布規(guī)律：除氣管外,各組織中都檢測(cè)到DHAV-3,且隨著感染時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng),大多數(shù)器官中DHAV-3的含量呈現(xiàn)不斷增殖趨勢(shì)。感染后56d, DHAV-3在肺臟、脾臟、十二指腸、腦、心臟、血液中的數(shù)量達(dá)到最大,其拷貝數(shù)分別為10~(7.86) copies、 10~(9.19) copies、10~(8.42)copies、10~(8.71) copies、10~(8.85) copies、10~(7.09) copies,70d病毒拷貝數(shù)有所下降。感染后70d, DHAV-3在法氏囊、食管、肌胃、腺胃、空腸、回腸、盲腸、直腸、腎臟、肌肉、中的增殖達(dá)到最高峰,其拷貝數(shù)在10~(7.57) copies-10~(8.49) copies。在上述器官中,最高峰時(shí)DHAV-3在脾臟中含量最高。(3)排泄規(guī)律：接毒1d-70d,口腔唾液、胃內(nèi)容物、腸道內(nèi)容物、泄殖腔內(nèi)容物中DHAV-3含量呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),70d時(shí)達(dá)到最高,其拷貝數(shù)在10~(5.61) copies-10~(6.92) copies。 DHAV-3在肌胃內(nèi)容物中含量最小,在空腸內(nèi)容物中拷貝數(shù)最大。5、三種檢測(cè)DHAV-3方法比較將本研究建立的qPCR和]real-time RT-LAMP與RT-PCR同時(shí)檢測(cè)30個(gè)臨床樣本,結(jié)果表明real-time RT-LAMP與RT-PCR的特異性、靈敏性、符合率是一致;real-time RT-LAMP與qPCR的特異性均為100%,靈敏性為84.21%,符合率為90%。qRT-PCR和qPCR只需要1對(duì)引物,real-time RT-LAMP需要3對(duì)引物。qRT-PCR和qPCR需要90 min-120 min; real-time RT-LAMP需要50min。三種檢測(cè)方法中以qRT-PCR的特異性、靈敏度最高。
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65

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