基因免疫制備新城疫病毒磷蛋白的單克隆抗體
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《揚州大學》 2005年
基因免疫制備新城疫病毒磷蛋白的單克隆抗體
馬卉
【摘要】:制備新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)的單克隆抗體(以下簡稱單抗),如果用全病毒做免疫抗原和篩選抗原,得到的NDV的單抗多是針對該病毒的優(yōu)勢抗原表位;而磷蛋白(P蛋白)是NDV的內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白,且其蛋白含量占整個病毒蛋白含量的比例很小,為病毒的非優(yōu)勢抗原表位,如果用全病毒做免疫抗原和篩選抗原,那么能夠得到分泌針對P蛋白的單抗的細胞株的可能性很小。 本實驗的目的是制備針對P蛋白特異的單抗,供研究P基因的結(jié)構(gòu)和功能使用。我們采用P蛋白基因的真核重組表達質(zhì)粒作DNA免疫的方法免疫小鼠,而以P基因的原核表達產(chǎn)生的融合蛋白經(jīng)純化后作為篩選抗原來制備針對P蛋白的單抗。首先,我們構(gòu)建了NDVP基因的真核重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-P;經(jīng)酶切和PCR鑒定,確定P基因是以正確的方向插入pcDNA3.1(-)后,用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染入COS-1細胞,于轉(zhuǎn)染后72小時采用間接免疫熒光的方法確定該重組質(zhì)粒在體外真核細胞中可以表達目的蛋白;然后大量提取質(zhì)粒,將其作為DNA免疫的材料,免疫6周齡的BALB/C小鼠,每只小鼠腿部肌肉注射裸質(zhì)粒100gg,隔2周免疫一次,共免疫4次,最后一次加強免疫后7天,取免疫小鼠的脾細胞和處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞SP2/0-Ag-14進行融合。同時,用原核表達載體pGEX-6p-1構(gòu)建P基因的的原核表達質(zhì)粒:經(jīng)酶切和PCR鑒定后,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21,37℃經(jīng)IPTG誘導表達;將誘導產(chǎn)生的融合蛋白(GST-P)經(jīng)SDS-PAGE和Western-Blot鑒定后作為篩選包被抗原。通過間接ELISA對融合的雜交瘤細胞進行篩選,將獲得的陽性細胞株用有限稀釋法進行多次亞克隆后,獲得一株分泌針對P蛋白的特異性單抗的細胞株,命名為2G8,細胞上清效價為1:256,腹水效價為1:2×10~4,亞類鑒定為IgM。用鵝源新城疫病毒ZJ-1株感染雞胚成纖維細胞做間接免疫熒光試驗鑒定2G8的特異性,結(jié)果顯示了特異性的綠色熒光;Western-Blot結(jié)果也顯示了單抗的良好特異性。
【關(guān)鍵詞】:
【學位授予單位】:揚州大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2005
【分類號】:S852.65
【目錄】:
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【引證文獻】
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10 于淼;高分子微球檢測新城疫病毒的研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2006年
本文關(guān)鍵詞:基因工程技術(shù)在畜牧獸醫(yī)上的應用及展望,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
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