本文關(guān)鍵詞：兔須癬毛癬菌的鑒定及快速診斷方法的建立

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【摘要】：兔皮膚真菌病是由皮膚癬菌引起的一類傳染性很強的接觸性傳染病。在世界范圍內(nèi)廣泛流行。兔須癬毛癬菌病不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)經(jīng)濟效益,還是人畜共患傳染病,引起人皮膚真菌病,嚴(yán)重危害養(yǎng)殖生產(chǎn)者及公眾健康。因此,對須癬毛癬菌進行準(zhǔn)確鑒定,并建立特異,敏感的,快速的診斷方法,篩選出有效的抗真菌藥物,對于養(yǎng)殖生產(chǎn)及公眾健康具有重要意義。采用r DNA-ITS序列分析結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)和生理學(xué)試驗對兔須癬毛癬菌進行鑒定。從疑似患兔采集皮屑樣品接種沙保弱培養(yǎng)基,觀察菌落特征及菌絲顯微結(jié)構(gòu),并進行尿素酶和毛發(fā)穿孔試驗。提取分離株(29株)DNA,利用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物測序后在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對,結(jié)果顯示,分離株的菌落形態(tài)為白色粉末狀,背面有色素沉著,培養(yǎng)可見大量葡萄狀小分生孢子,螺旋菌絲及棒狀大分生孢子;尿素酶和毛發(fā)穿孔試驗陽性;rDNA-ITS序列比對結(jié)果顯示,分離株與須癬毛癬菌復(fù)合體中的萬博節(jié)皮菌同源性在99.2%以上;從形態(tài)學(xué)和生理學(xué)試驗符合須癬毛癬菌的特點,結(jié)合分子生物學(xué)試驗將29株分離株鑒定為萬博節(jié)皮菌。利用幾丁質(zhì)酶基因(CHS1)序列分析結(jié)合菌落特征對兔須癬毛癬菌分離株(31株)進行分型。結(jié)果顯示菌落特征分為顆粒型、粉末型和絨毛型3種表型,其中多數(shù)為顆粒型和粉末型,占87.09%(27/31),基于CHS1序列同源性差異,分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5種基因類型,其中Ⅰ型和Ⅱ型是優(yōu)勢菌株,占54.84%(17/31),這些提示CHS1序列分析可以用于須癬毛癬菌的基因分型。采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法對兔須癬毛癬菌進行定量檢測。結(jié)果表明,利用此方法可以檢測病原菌DNA的最低稀釋度為10-10,而常規(guī)PCR檢測病原菌DNA最低稀釋度為10-8。并且,特異性強,與犬小孢子菌、絮狀表皮癬、紅毛癬菌、白色念珠菌、煙曲霉等病原真菌沒有交叉反應(yīng);對于須癬毛癬菌分離株陽性檢出率為100%(10/10),臨床分離須癬毛癬菌陽性檢出率為86%(54/63)。證明采用熒光定量PCR方法對須癬毛癬菌進行快速診斷具有良好的可行性。對31株須癬毛癬菌對藥物的敏感性進行了研究。我們采用了11種常用抗真菌藥物利用紙片擴散法進行了藥敏試驗,結(jié)果表明:特比萘芬、克霉唑、伏立康唑?qū)毎_毛癬菌的抑制作用最強,31株菌對這三種藥物敏感率為100%,抗菌效果最好;其次為伊曲康唑、酮康唑、益康唑、兩性霉素-B、制霉菌素、咪康唑,31株菌對這幾種藥物的敏感率分別為93.55%、90.32%、83.87%、48.39%、32.26%、12.90%;5-氟胞嘧啶、氟康唑的抑菌效果最差,31株菌對其敏感率都為0%。通過對兔場須癬毛癬菌病原菌的分離培養(yǎng)及rDNA-ITS序列分析,對兔須癬毛癬菌進行了鑒定;并基于幾丁質(zhì)酶基因?qū)Ψ蛛x到的31株兔須癬毛癬菌進行了基因分型;建立了兔須癬毛癬菌SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法;通過進行兔須癬毛癬菌藥物敏感性試驗,進一步了解了兔須癬毛癬菌對抗真菌藥物的敏感性,為臨床用藥提供參考。
【學(xué)位授予單位】：河北工程大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.291

【參考文獻】

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本文編號：1306460