本文關鍵詞：牦牛HSPA12B基因的克隆及其在體外受精胚胎中的定位表達

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【摘要】：熱休克蛋白70-12B基因(heat shock 70k D protein-12B,HSPA12B)是HSP70家族中重要一員。HSPA12B可通過抑制胚胎內部ROS(活性氧自由基)的產(chǎn)生發(fā)揮細胞保護效應,同時也可通過與腫瘤抑制因子P53發(fā)生交互作用而抑制細胞凋亡。HSPA12B的生物學功能不僅局限于線粒體上,亞細胞碎片的免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),HSPA12B也定位于細胞內的其他部位。由于現(xiàn)對HSPA12B蛋白功能的認識僅局限于其可促進血管內皮細胞生長方面,對其在胚胎細胞中的表達和功能研究甚少,本研究采取RT-PCR法克隆牦牛HSPA12B基因,采用實時熒光定量(RT-q PCR)和免疫熒光方法檢測HSPA12B在早期體外受精胚胎2~4細胞期、5~8細胞期、桑椹胚和囊胚中的表達差異以及蛋白分布,以期從分子水平上掌握HSPA12B的蛋白結構、遺傳特性及其在體外受精胚胎發(fā)育過程中的生物學作用。研究結果表明:(1)克隆得到牦牛HSPA12B基因(Gene Bank登錄號:KR258751)。(2)生物學信息分析結果顯示,牦牛HSPA12B基因序列具有一個長705 bp的編碼區(qū),可編碼234個氨基酸,其中丙氨酸(Ala)含量最高(10.3%),天冬酰胺(Asn)含量最少(0.9%);同源性分析和系統(tǒng)進化樹顯示,它與黃牛(bos taurus)HSPA12B基因的同源性最高,為99.5%,表明HSPA12B基因在進化中具有高度保守性;編碼產(chǎn)物無信號肽,為非跨膜蛋白,不屬于分泌蛋白,整體表現(xiàn)為親水性。(3)HSPA12B基因在牦牛體外受精2~4細胞期胚胎、5~8細胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中均有表達;HSPA12B在2~4細胞期胚胎中的相對表達量分別是在5~8細胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中相對表達量的14.8148、4.2699和40.4858倍;HSPA12B在2~4細胞期胚胎中的相對表達量,均與在5~8細胞期胚胎、桑椹胚和囊胚中的相對表達量差異性極顯著(P0.01)。(4)牦牛早期體外受精胚胎各時期中均有HSPA12B蛋白熒光,在2~4細胞期胚胎、5~8細胞期胚胎和桑葚胚中,胞核HSPA12B的表達量較胞質弱;在囊胚中胞核HSPA12B的表達量較胞質強。提示,在體外培養(yǎng)的環(huán)境應激條件下,牦牛體外受精胚胎發(fā)育至囊胚時,HSPA12B蛋白的分布可能發(fā)生了移位。(5)HSPA12B在牦牛體外受精胚胎的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。HSPA12B可能起著抑制細胞凋亡,延緩細胞衰老,調控胚胎早期發(fā)育的作用。本實驗分析了HSPA12B蛋白的基本結構和遺傳特性,并檢測了HSPA12B在不同時期的牦牛體外受精胚胎中的分布和表達,以期從胚胎發(fā)育角度探討熱休克蛋白抑制細胞凋亡,延緩細胞衰老,調控細胞發(fā)育等作用,文章為進一步研究HSPA12B在體外受精胚胎發(fā)育過程中的細胞保護作用提供了參考。
【學位授予單位】：甘肅農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823.85

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本文編號：1242181