本文關(guān)鍵詞：柔嫩艾美耳球蟲胱硫醚β合成酶和保守蛋白CHP317特性的初步研究

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【摘要】：雞球蟲病是危害嚴(yán)重的寄生蟲病之一,每年都會給畜禽養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,該病是由頂復(fù)器門艾美耳屬球蟲寄生雞腸道所引起的。柔嫩艾美耳球蟲是目前已知的幾種艾美耳球蟲中致病力最強(qiáng)的一種,可以導(dǎo)致雞死亡。頂復(fù)器門原蟲嚴(yán)格營細(xì)胞內(nèi)寄生,它們?nèi)肭炙拗骷?xì)胞的機(jī)制相對保守,都會在宿主細(xì)胞膜與蟲體表面形成一個高度保守的運(yùn)動結(jié)構(gòu)(Moving Junction,MJ),對蟲體入侵宿主細(xì)胞起關(guān)鍵作用。對弓形蟲和瘧原蟲的研究表明,微線體分泌的頂膜抗原1(AMA1)是組成MJ的重要組分之一,雞球蟲和弓形蟲、瘧原蟲同屬于頂復(fù)器門原蟲,因此深入研究柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原1(EtAMA1)對于理解雞球蟲入侵宿主細(xì)胞的機(jī)制具有重要意義。本課題組在前期研究中利用酵母雙雜交技術(shù)篩選了可能與EtAMA1互作的蛋白,本研究選取了EST編號為23(Genbank登錄號:JZ905767)和317(Genbank登錄號:JZ905773)的兩個蛋白,驗證其和EtAMA1間的互作關(guān)系并對其功能做了初步研究。1.柔嫩艾美耳球蟲EtCBS和EtCHP317基因的克隆及生物信息學(xué)分析所選的兩個EST序列包含3’Ploy A末端,因此利用5’RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得這兩個基因的全長c DNA序列。其中編號為23的基因全長共2423 bp,ORF長1887 bp(201 bp-2087 bp),編碼629個氨基酸,預(yù)測分子量約68 k Da,既沒有跨膜結(jié)構(gòu)也沒有信號肽,預(yù)測有22個B細(xì)胞表面抗原位點,該基因編碼的蛋白與柔嫩艾美耳球蟲推測的胱硫醚β合成酶(cystathionine beta-synthase)100%同源,因此命名該基因為柔嫩艾美耳球蟲胱硫醚β合成酶(EtCBS);基因317全長共1113 bp,其中ORF長501 bp(71 bp-571 bp),編碼167個氨基酸,預(yù)測分子量大小約18 kDa,無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽,預(yù)測有8個B細(xì)胞表面抗原位點,該基因與保守的假象蛋白(hypothetical protein conserved,Etm102F05)100%同源,因此將該基因命名為EtCHP317。QRT-PCR的結(jié)果顯示EtCBS基因的m RNA在子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平最高,EtCHP317基因的m RNA在裂殖子階段轉(zhuǎn)錄水平最高。2.柔嫩艾美耳球蟲EtCBS和EtCHP317原核重組蛋白的表達(dá)及功能初步研究分別將基因EtCBS和EtCHP317的ORF克隆至原核表達(dá)載體p ET-28a上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,在16℃下經(jīng)IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)了重組蛋白His-EtCBS(rEtCBS)和His-EtCHP317(rEtCHP317),其中兩種重組蛋白均以可溶性形式表達(dá)。分別利用親和層析純化蛋白并用其免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體。采用間接免疫熒光(IFA)對EtCBS和EtCHP317在蟲體不同發(fā)育階段分布進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,其結(jié)果顯示:EtCBS主要位于子孢子和裂殖子的表面,當(dāng)子孢子入侵DF-1細(xì)胞時,該蛋白位于頂端,且隨著蟲體在細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育,含量也逐漸增多,推測該蛋白可能與蟲體的發(fā)育和入侵有關(guān)。而對EtCHP317的定位發(fā)現(xiàn),其主要也位于子孢子和裂殖子的表面,當(dāng)子孢子入侵DF-1時,該蛋白主要位于蟲體頂端和表面,推測該蛋白可能和蟲體入侵相關(guān)。體外抑制實驗結(jié)果顯示:隨著抗體濃度的增加,與正常對照組相比,anti-rEtCBS和anti-rEtCHP317抗體作用后的蟲體入侵能力顯著下降,當(dāng)抗體濃度達(dá)到400μg/m L,可以抑制約70%的蟲體入侵細(xì)胞,因此,推測這兩個蛋白在柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細(xì)胞過程中可能發(fā)揮著重要功能。3.柔嫩艾美耳球蟲EtCBS蛋白和EtCHP317蛋白與EtAMA1蛋白互作關(guān)系的驗證本研究分別將EtCBS與EtCHP317連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pBiFC-VN155上,構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-EtCHP317、pcDNA3.1-EtCBS、pBiFC-VN155-EtCBS和pBiFC-VN155-EtCHP317,且能在真核細(xì)胞DF-1中成功表達(dá)。為了驗證EtCBS、EtCHP317和EtAMA1間的相互作用,將EtCBS和EtAMA1與EtCHP317和EtAMA1真核表達(dá)質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,利用Co-IP方法將抗FLAG標(biāo)簽的抗體偶聯(lián)到載體上,通過抗體與目的蛋白之間的互作間接將目的蛋白沉淀出來,從而驗證蛋白之間的互作,結(jié)果說明EtCBS和EtAMA1不存在相互作用,而EtCHP317和EtAMA1間存在相互作用。同時利用雙分子熒光互補(bǔ)實驗(BiFC)驗證了EtCBS和EtAMA1與EtCHP317和EtAMA1的互作關(guān)系,BiFC的結(jié)果顯示,兩個實驗組中EtCBS實驗組無綠色熒光,而EtCHP317這一組可以觀察到特異綠色熒光,因此EtCBS和EtAMA1不存在相互作用,而EtCHP317和EtAMA1間存在相互作用。GST Pull-Down實驗結(jié)果也同樣證實了這一結(jié)論。4.柔嫩艾美耳球蟲rEtCBS和rEtCHP317的動物免疫保護(hù)性實驗將120只7日齡雛雞平均分成六組,20只雞為一組,分別為健康對照組、感染對照組、rEtCHP317(50μg/羽)+ISA71、rEtCHP317(100μg/羽)+ISA71、rEtCBS(50μg/羽)+ISA71、rEtCBS+ISA71(100μg/羽)。感染對照組免疫佐劑ISA71,其他實驗組按照相應(yīng)的劑量在7日齡、14日齡時進(jìn)行皮下免疫。二免8 d后除了健康對照組外,每只雞經(jīng)口接種柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊一萬個,攻蟲后9 d結(jié)束實驗。通過對雞的增重、盲腸病變的情況以及卵囊排出量等指標(biāo)綜合評價疫苗效果。結(jié)果顯示,和感染對照組相比,實驗組在增重、盲腸病變以及卵囊產(chǎn)出方面均有所改善,說明重組蛋白對抵抗球蟲入侵有一定的效果,可以增強(qiáng)機(jī)體抵抗球蟲感染的能力。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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本文編號：1231183