發(fā)布時(shí)間：2017-11-26 01:15

  本文關(guān)鍵詞：TSA和SAHA對(duì)阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的影響

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【摘要】：目前,體細(xì)胞核移植技術(shù)(somatic cell nuclear transfer, SCNT)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備、瀕危珍稀動(dòng)物保護(hù)等方面發(fā)揮著重要作用。然而,該技術(shù)中,作為核供體的體細(xì)胞具有較高分化程度,使得其不能完全被卵母細(xì)胞重編程,進(jìn)而導(dǎo)致克隆胚胎存在死亡率高、發(fā)育率低等問(wèn)題。研究表明,克隆胚胎表觀遺傳重編程的異常,是導(dǎo)致核移植技術(shù)生產(chǎn)效率低的重要原因。因此,研究人員逐漸傾向于利用分化程度更低的多能性干細(xì)胞作為克隆技術(shù)的供體細(xì)胞。然而,目前家畜胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng)還沒(méi)有獲得成功,因此還無(wú)法應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因家畜的制備。因此,問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作為一類成體干細(xì)胞,具有較低的分化程度和多向分化的潛能,且易于體外培養(yǎng),在家畜轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域越來(lái)越受到關(guān)注。脂肪組織來(lái)源的問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞以其來(lái)源豐富、易于培養(yǎng)以及具有多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn),在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)、細(xì)胞治療及組織工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。已有報(bào)道顯示,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-Derived Stem Cells, ADSCs)作為供體細(xì)胞進(jìn)行核移植,可以有效提高克隆胚胎的發(fā)育率。本研究以阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(goat Adipose-Derived Stem Cells, gADSCs)為研究對(duì)象,探討曲古菌素A(Trichostatin A, TSA)和伏立諾他(Vorinostat, SAHA)兩種組蛋白去乙�；敢种讫R(Histone deacetylase inhibitor, HDACi)對(duì)其組蛋白乙酰化修飾、多能性及分化的調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步將該細(xì)胞應(yīng)用于高效生產(chǎn)克隆和轉(zhuǎn)基因絨山羊等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。一、TSA和SAHA處理對(duì)gADSCs組蛋白H3K9乙酰化作用1、gADSCs生長(zhǎng)曲線的繪制根據(jù)連續(xù)7天細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)gADSCs的生長(zhǎng)符合細(xì)胞生長(zhǎng)的“S”規(guī)律,生長(zhǎng)速度較快,生長(zhǎng)狀態(tài)良好。2、TSA和SAHA處理對(duì)gADSCs增殖活性的影響分別用500nM TSA和16μM SAHA處理gADSCs 24h、48h和72h,利用MTT法分析對(duì)照組、TSA與SAHA處理組的細(xì)胞活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TSA與SAHA處理24h細(xì)胞增殖活性最高,隨處理時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞增殖活性逐漸下降。3、免疫熒光和Western blot檢測(cè)gADSCs組蛋白H3K9乙酰化水平變化500nM TSA和16μM SAHA分別處理gADSCs 24h。免疫熒光結(jié)果顯示,細(xì)胞中組蛋白H3K9乙�；療晒庑盘�(hào)強(qiáng)度顯著高于未處理的對(duì)照組。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,組蛋白H3K9乙酰化水平顯著升高,且TSA比SAHA的作用效果更加明顯(P0.01)。結(jié)果表明,TSA和SAHA處理,能使組蛋白H3K9高度乙酰化。4、Q-PCR和Western blot檢測(cè)gADSCs中HDACs表達(dá)情況Q-PCR檢測(cè)HDACs轉(zhuǎn)錄水平顯示,與未處理的對(duì)照組細(xì)胞相比,500nMTSA和16μM SAHA分別處理gADSCs 24h, HDAC1和HDAC6的轉(zhuǎn)錄水平升高；TSA使gADSCs中SIRT1的轉(zhuǎn)錄升高,而SAHA卻使其轉(zhuǎn)錄下降。Western blot檢測(cè)gADSCs中HDACs表達(dá)情況,TSA和SAHA使HDAC1和HDAC6的表達(dá)顯著提高,SIRT1的表達(dá)水平顯著下降(P0.01)。二、TSA和SAHA上調(diào)組蛋白H3K9乙�；綄�(duì)gADSCs增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因表達(dá)的影響1、TSA和SAHA處理引起gADSCs細(xì)胞周期停滯和凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)500nM TSA和16μM SAHA分別處理gADSCs 24h的細(xì)胞周期分布與凋亡情況,發(fā)現(xiàn)TSA和SAHA處理阻斷gADSCs細(xì)胞周期,使細(xì)胞停滯在G0/G1期,并且顯著發(fā)生早期凋亡。2、Q-PCR檢測(cè)TSA和SAHA處理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化Q-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),處理后的細(xì)胞中NANOG、OCT4、SOX2多能性基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。增殖相關(guān)基因TERT轉(zhuǎn)錄水平升高,PCNA轉(zhuǎn)錄水平降低。而凋亡相關(guān)基因P53和BAX的轉(zhuǎn)錄均顯著降低。3、Western blot檢測(cè)TSA和SAHA處理后gADSCs增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因的蛋白水平變化Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,處理后的細(xì)胞中NANOG、OCT4多能性基因在蛋白質(zhì)水平表達(dá)量升高,SOX2表達(dá)降低。而增殖相關(guān)基因TERT和PCNA,凋亡相關(guān)基因P53均顯著降低,BAX顯著升高。三、TSA和SAHA上調(diào)組蛋白H3K9乙酰化水平對(duì)gADSCs向脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化的影響1、TSA和SAHA處理對(duì)于gADSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響通過(guò)體外脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組細(xì)胞正常分化為脂肪細(xì)胞,表明分化體系健全。在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中,TSA和SAHA處理可以提高脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá),其中脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體y2(PPARG2)顯著升高。通過(guò)油紅O染色與脂滴定量顯示,TSA和SAHA促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。2、TSA和SAHA處理對(duì)于gADSCs向神經(jīng)分化的影響免疫熒光法檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞正常分化為神經(jīng)細(xì)胞,表明神經(jīng)分化體系可靠。在體外神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)研究過(guò)程中,TSA和SAHA促進(jìn)神經(jīng)分化關(guān)鍵基因EN02和NeuN的轉(zhuǎn)錄。綜上所述,本研究使用TSA和SAHA處理阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞降低了組蛋白去乙酰化酶的活性,促使組蛋白H3K9乙�；斤@著提高,激活基因的表達(dá)并提高細(xì)胞的分化潛能。TSA和SAHA處理后的阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的提高,為其作為高效的供體細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物胚胎奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：1228041