本文關鍵詞：弓形蟲熒光定量PCR檢測方法及HRM分型方法的建立

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【摘要】：弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種呈世界性分布的人獸共患寄生性原蟲病,病原是真球蟲目、肉孢子蟲科、弓形蟲屬的剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)。該蟲可寄生在幾乎所有溫血動物的有核細胞內,嚴重危害人類的健康及畜牧業(yè)的發(fā)展。研究報道:國內豬的弓形蟲感染率從12%~100%不等,病死率可達60%以上。弓形蟲病正嚴重危害著中國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前,該蟲有三個國際公認的傳統(tǒng)基因型,即TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中TypeⅠ型為強毒基因型,Ⅱ型和Ⅲ型為弱毒基因型。本論文選取TypeⅠ型標準蟲株RH株,Ⅱ型標準蟲株PRU株及Ⅲ型標準蟲株VEG株作為研究對象,以致密顆粒蛋白7(GRA7)基因為靶基因,建立弓形蟲病的熒光定量PCR檢測方法及弓形蟲三種標準蟲株HRM基因分型方法,為弓形蟲的分子生物學檢測、種群遺傳學及流行病學調查奠定基礎。為建立一種弓形蟲病的快速檢測方法,在弓形蟲致密顆粒蛋白7(GRA7)基因種內保守的區(qū)域設計種特異性引物,建立弓形蟲病的熒光定量PCR檢測方法,并應用于臨床檢測。結果顯示,該檢測方法特異性強,除弓形蟲陽性樣品出現(xiàn)擴增外,豬等孢球蟲、豬附紅細胞體、新孢子蟲、犬鉤蟲、貓藍氏賈第蟲等沒有擴增;操作簡單、快速、從提取樣品基因組到出檢測結果全程需時大概100 min左右;敏感度高、最低可以檢測到含1個拷貝靶基因的陽性質粒及含10個速殖子的臨床樣品;穩(wěn)定性好,組內及組間Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于2%。用所建立的檢測方法對廣東地區(qū)9個規(guī)�；l(fā)病豬場送檢的360份臨床樣品進行檢測并結合抽樣測序,結果顯示該地區(qū)這幾個規(guī)�；i場的弓形蟲感染率較高,樣品陽性率高達63.0%,同時提醒養(yǎng)殖場畜主要正確及時使用藥物進行控制,加強監(jiān)測,避免爆發(fā)式發(fā)病。該方法對豬弓形蟲病的流行病學調查及其防治具有一定意義。為建立一種弓形蟲三種蟲株的快速基因分型方法,本研究選取弓形蟲致密顆粒蛋白7(GRA7)作為靶基因,采用HRM技術對國際公認的三個傳統(tǒng)基因型的標準蟲株(TypeⅠ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VEG株)進行基因分型。結果顯示,本研究所設計的引物HRM-F和HRM-R,在優(yōu)化的反應條件下能明顯區(qū)分TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型。HRM分型方法的穩(wěn)定性試驗結果顯示、三次的組內和組間重復性均良好;敏感性試驗結果顯示,當樣品濃度低至5×10-4 ng/μL時,HRM分型方法依然可以辨別出基因型。用所建立的分型方法對9份臨床陽性樣品進行檢測,結果顯示4份人源樣品和1份魚源樣品為TypeⅡ型,可信度90.82%以上;2份猴源樣品為TypeⅠ型,可信度91.34%以上;其它2份豬源樣品未能定出其基因型,推測可能其屬于一種地域特有的基因型。本研究所建立的HRM基因分型方法具有快速、穩(wěn)定、敏感和準確的特點,適用于弓形蟲的臨床分類研究和分子流行病學調查。
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 袁曉娟;黃增榮;趙孝木;莫興虎;汪忠榮;;豬弓形蟲病診斷方法研究進展[J];貴州畜牧獸醫(yī);2015年06期

2 候照峰;王尚尚;賈紅;臧傳佼;朱鴻飛;周永華;陶建平;;弓形蟲熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用[J];中國獸醫(yī)雜志;2015年01期

3 劉俠;闞松鶴;林青;;弓形蟲病研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2015年01期

4 張國新;何劍斌;楊娜;袁高明;慕名揚;王大為;李紅魁;;弓形蟲基因分型研究進展[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2014年11期

5 薛峰;洪彩玲;黃敏君;孫嵐;甘紹伯;谷俊朝;;弓形蟲GRA7致密顆粒蛋白與宿主巨噬細胞蛋白的相互作用[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2014年05期

6 李倩;張莉;李海龍;;非人靈長類弓形蟲病研究進展[J];中國人獸共患病學報;2014年05期

7 王旭;;弓形蟲病診斷技術概述[J];湖北畜牧獸醫(yī);2013年12期

8 賈玉璽;聶大平;陳凌娟;申麗潔;李偉;;世界各地不同基因型弓形蟲流行概況[J];中國病原生物學雜志;2013年10期

9 王林;沈繼龍;;剛地弓形蟲基因型和與基因型相關的致病機制研究進展[J];中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志;2013年04期

10 趙東岳;黃翠琴;王琨;溫福利;岳良平;王壽昆;林旋;;三重SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR與ELISA檢測弓形蟲的比較[J];中國人獸共患病學報;2013年05期

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本文編號：1227030