本文關(guān)鍵詞：2型豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白的表達(dá)生產(chǎn)

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【摘要】：2型豬圓環(huán)病毒(PCV2)是一種侵略性病原,可引起豬的一系列相關(guān)疾病(PCVAD),給世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。PCV2的衣殼蛋白(Cap)是重要的保護(hù)性抗原,CapN端41個(gè)氨基酸為核定位信號(hào)序列(NLS),研究表明NLS序列中不包含蛋白的抗原表位,所以截短N(yùn)LS序列后的Cap (tCap)與原蛋白相比具有相同的免疫原性,都具有開發(fā)成為PCV2亞單位疫苗的潛力。本文利用大腸桿菌,畢赤酵母,桿狀病毒三個(gè)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)tCap進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn),為PCV2亞單位疫苗的開發(fā)打下了基礎(chǔ)。首先,我們?cè)诖竽c桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行了tCap的表達(dá)。將密碼子優(yōu)化的opti-tcap口tcap分別插入到pET28a(+)載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),密碼子優(yōu)化提升了活性tCap的表達(dá)量。收獲的tCap通過雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)進(jìn)行體外檢測(cè),效價(jià)達(dá)到1：8,顯示出了良好的免疫原性。其次,我們?cè)诋叧嘟湍窯S115系統(tǒng)中進(jìn)行了tCap的分泌表達(dá)。將密碼子優(yōu)化的opti-tcapl和tcap分別插入pPIC9K表達(dá)載體中,通過篩選獲得表達(dá)質(zhì)粒高拷貝整合的菌株,并在5L生物反應(yīng)器中進(jìn)行了菌株的高密度發(fā)酵。發(fā)酵液上清中檢測(cè)到了tCap蛋白的分泌表達(dá),產(chǎn)量達(dá)到0.25g/L。進(jìn)一步在小鼠和豬模型上進(jìn)行了純化tCap蛋白的體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明：tCap能夠在動(dòng)物體內(nèi)激發(fā)PCV2 Cap特異性抗體的產(chǎn)生,其抗體激活水平與商業(yè)化亞單位疫苗相當(dāng)。最后,我們?cè)诶ハx細(xì)胞Sf9系統(tǒng)中進(jìn)行了tCap的表達(dá)。將tcap插入到pFastBacHTB轉(zhuǎn)移載體中,通過轉(zhuǎn)座交換到桿狀病毒質(zhì)粒bacmid上。將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-tcap轉(zhuǎn)入Sf9細(xì)胞中,收獲病毒,并用P3代病毒感染細(xì)胞以表達(dá)tCap。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桿狀病毒表達(dá)的可溶性tCap具有良好的免疫原性,體外能夠檢測(cè)到1倍抗體效價(jià)。
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1216606