發(fā)布時(shí)間：2017-11-21 02:17

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞松弛素B對(duì)豬孤雌胚胎DNA甲基化和組蛋白修飾的影響

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【摘要】：細(xì)胞松弛素B對(duì)豬孤雌胚胎DNA甲基化和組蛋白修飾的影響在胚胎發(fā)育過程中,雌雄原核發(fā)生一系列表觀遺傳變化,擦除來自親本的特異性修飾并建立新的胚胎表觀遺傳模式,其中DNA甲基化和組蛋白修飾在動(dòng)物胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用,不適當(dāng)?shù)谋碛^遺傳修飾能引起胚胎發(fā)育異常甚至死亡。細(xì)胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)是肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑,它能顯著地影響細(xì)胞活力,常用于細(xì)胞學(xué)研究。近年來,CB也常用于哺乳動(dòng)物體外胚胎實(shí)驗(yàn)中,如CB能誘導(dǎo)四倍體或者二倍體胚胎的形成;在胚胎冷凍中提高存活率;在哺乳動(dòng)物孤雌胚胎激活中,CB常與其他激活方式協(xié)同作用改善胚胎發(fā)育能力;在體細(xì)胞核移植中能避免卵母細(xì)胞破碎、保證活化胚胎染色體倍數(shù)。而CB對(duì)胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳修飾的影響一直少有研究,其影響機(jī)制也不得而知。本實(shí)驗(yàn)以豬電激活孤雌胚胎為研究對(duì)象,通過在胚胎培養(yǎng)液PZM-3中添加CB,對(duì)豬孤雌胚胎發(fā)育中DNA甲基化和組蛋白修飾的變化進(jìn)行了研究。有研究指出,甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNMTi)和組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)能通過改變DNA甲基化或者組蛋白修飾促進(jìn)哺乳動(dòng)物核移植胚胎和孤雌胚胎的發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)選用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-Cdr和組蛋白去乙�；敢种苿㏒criptaid與CB共同作用于豬孤雌胚胎,進(jìn)一步探究三者的協(xié)同作用對(duì)豬孤雌胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果如下:1、用不同濃度的CB處理豬卵母細(xì)胞孤雌激活胚胎4 h,結(jié)果顯示:5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的CB能顯著提高孤雌胚胎的卵裂率(87.48%,88.52%,79.35%),5μg/mL和7.5μg/mL的CB能顯著提高囊胚率(33.31%,33.24%);各濃度CB均能促進(jìn)囊胚多能性基因Oct4、Sox2、Nanog的表達(dá),5μg/mL組與其他實(shí)驗(yàn)組相比能極顯著上調(diào)Nanog的表達(dá);各濃度CB均能使凋亡相關(guān)基因Bcl-xl、Bax和Casp3的表達(dá)顯著降低,5μg/mL組與其他實(shí)驗(yàn)組相比能極顯著的降低Bax的相對(duì)表達(dá)量;5μg/mL組CB能使囊胚細(xì)胞數(shù)明顯上升至51.48個(gè),同時(shí)還能顯著降低囊胚細(xì)胞凋亡率(7.33%)。根據(jù)以上結(jié)果選用5μg/mL的CB濃度做后續(xù)研究。2、本實(shí)驗(yàn)選用5μg/mL的CB處理豬卵母細(xì)胞4 h,利用熒光定量PCR和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)了在孤雌激活胚胎發(fā)育過程中,相關(guān)基因和表觀遺傳標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果顯示,甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的表達(dá)降低,促進(jìn)5mC向5hmC的轉(zhuǎn)變,說明CB處理能抑制胚胎的甲基化;Hat1和Hdac1的表達(dá)在原核時(shí)期都顯著降低,AcH3K9的表達(dá)明顯上升而H3K9me3表達(dá)顯著下降,說明CB處理能提高胚胎的乙酰化程度;多能性基因Oct4在囊胚期,Nanog、Sox2在4細(xì)胞至囊胚時(shí)期的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,進(jìn)一步證明CB能激活轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)基因的表達(dá);印記基因H19和Igf2的表達(dá)量有一定變化,而在CB組和對(duì)照組中,H19從GV期到8細(xì)胞期以及Igf2在桑椹胚和囊胚期都幾乎不表達(dá),說明CB對(duì)孤雌胚胎印記基因的缺陷只有一定的緩解作用,不能改變其表達(dá)趨勢(shì)。3、本實(shí)驗(yàn)用CB、Scriptaid和5-Aza-Cdr三種藥物組合處理豬孤雌激活的胚胎,研究其對(duì)胚胎發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)分為1個(gè)對(duì)照組和7個(gè)實(shí)驗(yàn)組,7個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別是:CB、Scriptaid、5-Aza-Cdr、CB+Scriptaid、CB+5-Aza-Cdr、Scriptaid+5-Aza-Cdr和CB+Scriptaid+5-Aza-Cdr。結(jié)果表明,5μg/mL CB能夠補(bǔ)充或者進(jìn)一步促進(jìn)Scriptaid、5-Aza-Cdr和Scriptaid+5-Aza-Cdr對(duì)胚胎發(fā)育的影響,提高卵裂率或囊胚率并進(jìn)一步降低凋亡相關(guān)基因的Bcl-xl、Bax和Casp3的表達(dá)水平,促進(jìn)豬孤雌胚胎的發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 ZHOU Yan;HUANG YongYe;XIE WanHua;SONG Qi;JI Yuan;ZHANG YanPing;OUYANG HongSheng;LAI LiangXue;PANG DaXin;TANG XiaoChun;;Scriptaid affects histone acetylation and the expression of development-related genes at different stages of porcine somatic cell nuclear transfer embryo during early development[J];Chinese Science Bulletin;2013年17期

2 康雅雅;馬紅;任亮;趙誠(chéng)悅;齊貴龍;柳櫻子;劉娣;;曲古抑菌素A和5-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)豬孤雌胚胎發(fā)育的影響[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2013年07期

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本文編號(hào)：1209340