本文關鍵詞：實驗動物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測方法的建立與初步應用

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【摘要】：目的:實驗動物是生命科學研究的基礎和條件,實驗動物的質量直接影響眾多領域科學實驗的準確性,也關系到實驗動物從業(yè)人員和動物實驗操作者的健康。因此,實驗動物的微生物質量控制已納入國家標準。肺支原體(Mycoplasma pulmonis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是實驗動物微生物檢測需要排除的病原體,也是實驗動物常見的易感病原體,在大小鼠、豚鼠、地鼠和兔中感染率可達到百分之幾,甚至百分之幾十,相對其它病原體感染率較高。目前對實驗動物攜帶的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體的鑒定主要以分離純化培養(yǎng)、生化試驗等方法進行,存在費時費力、需要有經驗的技術人員以客觀指標加主觀判斷鑒定的缺點,如金黃色葡萄球菌從分離細菌到發(fā)出檢測報告往往需要48h,綠膿桿菌需要長達72h,而肺支原體培養(yǎng)完成檢測則需21天。而PCR(Polymerase Chain Reaction)技術以其簡便、快速、準確等優(yōu)點已在臨床醫(yī)學疾病診斷等領域得到廣泛應用,理論上同樣也可應用于實驗動物的病原微生物檢測,但普通PCR方法單管每次只能檢測一種病原體,不能滿足單管檢測多種病原體的實際需要,更滿足不了大樣本、快速、準確的檢測。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一管反應體系中擴增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高通量等優(yōu)點。多重PCR如果應用在實驗動物微生物檢測中,可以同時檢測多種病原體,適合大量實驗動物微生物檢測與鑒定,具有高靈敏性、高效性、高特異性和低成本性等優(yōu)點。本研究目的是針對三種實驗動物病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體,建立多重PCR檢測方法,并與傳統(tǒng)的微生物檢測方法比較,檢驗多重PCR檢測方法的可操作性和準確性。方法:1、將金黃色葡萄球菌標準株轉接到SP瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h后轉接到血液瓊脂培養(yǎng)基上進行分離與純化培養(yǎng),顯微鏡鏡下觀察,進行血漿凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗;將綠膿桿菌標準株轉接到NAC液體培養(yǎng)基,后轉接到nac固體培養(yǎng)基上進行分離與純化培養(yǎng),顯微鏡鏡下觀察,生化鑒定,氧化酶試驗,42℃生長試驗;將肺支原體接到液體培養(yǎng)基中,一周后進行觀察。2、通過文獻查找肺支原體、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌特異性引物,使用blast分析各病原體引物特異性;進行pcr擴增,對擴增產物進行測序,通過生物信息學分析驗證擴增產物正確性;3、優(yōu)化pcr反應體系,檢測pcr方法的特異性和敏感性。將模板dna按照10倍的比例進行梯度稀釋,分別以稀釋后的模板dna進行擴增;用接種針挑取菌落加入到裝有普通營養(yǎng)肉湯的試管中,放入37℃恒溫搖床中進行擴菌,將搖好的菌液按著10倍比例進行梯度稀釋,轉接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),提取菌液核酸進行pcr擴增;pcr擴增其他非目的菌進行特異性實驗。4、將肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的基因組dna在同一反應體系同時擴增,并且在反應體系中加入細菌通用引物做為內質控,調整和優(yōu)化反應體系成分和反應條件,建立三種病原體多重pcr檢測方法。選擇具有實驗動物生產資質的單位供應的動物:大小鼠共45只,采集實驗動物回盲部內容物或糞便以及動物氣管分泌物,提取核酸進行三種病原體多重pcr的檢測,同時進行傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法,將兩種檢測結果比較,檢驗多重pcr檢測方法的可操作性和準確性。結果:1、金黃色葡萄球菌在sp固體培養(yǎng)基上形成黃色的菌落,轉接血瓊脂平皿形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落;菌體形態(tài)為革蘭陽性球菌,排列成葡萄狀;甘露醇發(fā)酵試驗為陽性;血漿凝固酶試驗為陽性。綠膿桿菌在nac瓊脂平皿上形成扁平菌落,邊緣不齊呈鋸齒狀,大部分菌落可產生綠色色素而致使培養(yǎng)基呈綠色;菌體特征為革蘭陰性桿菌,菌體長短不一;各生化鑒定管陰陽性結果正確;氧化酶試驗和42℃生長試驗為陽性。肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。2、獲得三種病原體的特異性引物,并通過blast比對驗證引物的特異性,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體擴增產物大小分別為153bp、375bp和266bp,其測序結果分別與genebank對應序列(sequenceid分別為:gb|dq507378.1、dbj|ab926025.1、gb|kp836312.1)相似度分別為97.00%、98.90%和99.59%。3、PCR特異性實驗:金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體特異性實驗結果,除標準菌株擴增出陽性條帶外,其它菌種均擴增陰性;敏感性實驗:金黃色葡萄球菌PCR擴增最小檢出DNA核酸量為1pg、最小檢出菌落數(shù)為2CFU;綠膿桿菌PCR擴增最小檢出DNA核酸量為10pg,最小檢出菌落數(shù)為14CFU;肺支原體PCR擴增最小檢出DNA核酸量為1pg。4、建立了金黃色葡萄球菌、肺支原體、綠膿桿菌和細菌通用基因的多重PCR擴增體系,其產物經瓊脂糖電泳出四個條帶,片段大小從小到大分別為153bp、266bp、375bp和520bp。PCR檢測實驗動物24h培養(yǎng)物中的菌落,其結果與實驗動物微生物檢測結果一致;檢測實驗動物糞便,檢測結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法相比有差異。結論:成功建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測體系,有較好的敏感性、特異性和重復性。用于實驗動物微生物檢測,檢測結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法一致,并且多重PCR方法快速、簡便、準確,初步驗證了本檢測方法具有良好的可操作性和準確性,為今后應用于實驗動物微生物的檢測奠定了基礎。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.91

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本文編號：1184144