本文關(guān)鍵詞：胞外鈣離子對豬BMSCs增殖和成脂分化的影響及作用機制

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種多能干細胞,可向肌細胞和脂肪細胞分化,從而影響動物體內(nèi)肌肉和脂肪的組成。因此,研究BMSCs的增殖和成脂分化對于調(diào)控動物不同部位脂肪沉積、提高肉品質(zhì)具有重要的意義。Ca~(2+)是普遍存在于細胞內(nèi)的重要信號物質(zhì),對細胞的增殖和脂肪生成具有重要的調(diào)控作用。然而,胞外鈣離子([Ca~(2+)]_o)對豬骨髓間充質(zhì)干細胞(pBMSCs)增殖和成脂分化的影響及其作用機制還不清楚。首先,我們采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了[Ca~(2+)]_o對pBMSCs成脂分化過程中不同時間細胞膜上鈣離子通道,包括L型電壓門控鈣通道(L-VGCC)亞型α/δ1(CACNA2D1)、鈣釋放激活鈣通道調(diào)控分子1(Orai1)、瞬時受體電位通道香草素受體亞型1(TRPV1),以及鈣敏感受體(CaSR)基因mRNA表達的影響。其次,我們采用CCK-8試劑盒、流式細胞分析、熒光定量PCR及Western blot等方法分別檢測了[Ca~(2+)]_o和/或nifedipine(L-VGCC阻斷劑)、NPS2143(CaSR阻斷劑)、U0126(ERK通路阻斷劑)對pBMSCs增殖過程中的細胞數(shù)目、細胞周期分布、胞內(nèi)鈣離子([Ca~(2+)]_i)濃度以及增殖相關(guān)基因、CaSR和ERK表達的影響,揭示了[Ca~(2+)]_o對pBMSCs增殖的影響及作用機制。最后,我們研究了[Ca~(2+)]_o對pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收的影響及其信號通路。采用油紅O染色、TG濃度檢測研究了[Ca~(2+)]_o和/或nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM([Ca~(2+)]_i螯合劑)、KN-93(Ca MKII阻斷劑)、Wortmannin(PI3K通路阻斷劑)對pBMSCs成脂分化10天細胞聚酯的影響;通過Western blot進一步研究了[Ca~(2+)]_o和各阻斷劑對pBMSCs成脂相關(guān)基因(PPARγ、CEBPα、aP2)、CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1和AS160表達的影響。此外,我們還通過葡萄糖檢測試劑盒、2-NBDG熒光葡萄糖吸收試劑盒、Western blot等方法研究了[Ca~(2+)]_o對pBMSCs成脂過程中葡萄糖消耗及吸收、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)表達與轉(zhuǎn)位的影響及調(diào)控機制。研究結(jié)果如下:1、在pBMSCs成脂分化第5天,4 mM[Ca~(2+)]_o極顯著促進細胞膜上鈣離子通道(CACN2D1、Orai1、TRPV1)以及CaSR基因的mRNA表達,提示[Ca~(2+)]_o及相關(guān)的細胞膜上的鈣離子通道、CaSR可能在pBMSCs成脂分化的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。2、[Ca~(2+)]_o劑量依賴性促進pBMSCs增殖,且[Ca~(2+)]_o顯著促進pBMSCs增殖過程中CaSR的mRNA和蛋白表達;[Ca~(2+)]_o能夠升高pBMSCs增殖過程中[Ca~(2+)]_i濃度,促進pBMSCs增殖過程中S期的細胞分布比例和細胞增殖指數(shù)(PI),同時抑制G0/G1期細胞分布比例;[Ca~(2+)]_o能夠促進pBMSCs促增殖相關(guān)基因(cyclinA2/D1/D3/E2、PCNA)的mRNA和/或蛋白表達,同時抑制p21基因的mRNA和蛋白表達;此外,[Ca~(2+)]_o能夠促進pBMSCs增殖過程中ERK1/2蛋白磷酸化;而阻斷CaSR或抑制ERK1/2信號通路均能夠逆轉(zhuǎn)[Ca~(2+)]_o促進pBMSCs增殖及ERK通路激活的效果。以上結(jié)果提示,[Ca~(2+)]_o通過激活細胞膜上CaSR,提高胞內(nèi)鈣離子濃度,激活胞內(nèi)ERK信號通路,進而促進pBMSCs的增殖。3、[Ca~(2+)]_o顯著升高pBMSCs成脂過程中[Ca~(2+)]_i的濃度,促進胞內(nèi)TG含量及成脂相關(guān)基因PPARγ、CEBPα、aP2的蛋白表達;抑制VGCC和CaSR可阻斷[Ca~(2+)]_o對[Ca~(2+)]_i的升高作用;同時,[Ca~(2+)]_o顯著促進CaMKII、PI3K/Akt及其下游FoxO1的磷酸化;nifedipine、NPS2143、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能夠逆轉(zhuǎn)[Ca~(2+)]_o對pBMSCs成脂分化以及CaMKII、PI3K/Akt和FoxO1磷酸化的促進作用。以上結(jié)果提示,[Ca~(2+)]_o通過VGCC和CaSR促進[Ca~(2+)]_i的升高,進而激活CaMKII-PI3K/Akt-Fox O1通路,從而促進pBMSCs的成脂分化。4、[Ca~(2+)]_o顯著促進細胞GLUT4的表達和轉(zhuǎn)位、加強細胞的葡萄糖消耗和吸收,同時促進細胞CaMKII、PI3K/Akt和AS160的磷酸化;而nifedipine、BAPTA-AM、KN-93、Wortmannin均能逆轉(zhuǎn)[Ca~(2+)]_o對pBMSCs成脂過程中GLUT4表達及轉(zhuǎn)位、葡萄糖吸收與消耗的促進作用。上述結(jié)果提示,[Ca~(2+)]_o通過VGCC促進[Ca~(2+)]_i的升高,進而激活CaMKII-PI3K/Akt-AS160通路,從而促進pBMSCs成脂過程中GLUT4的轉(zhuǎn)位及葡萄糖的吸收。綜上,[Ca~(2+)]_o顯著促進pBMSCs成脂過程中細胞膜鈣離子通道及CaSR的表達;[Ca~(2+)]_o通過激活pBMSCs細胞膜上的CaSR使[Ca~(2+)]_i濃度升高,進而激活胞內(nèi)ERK通路,促進細胞周期進程與細胞的增殖;在pBMSCs成脂分化中,[Ca~(2+)]_o可通過VGCC或激活CaSR升高[Ca~(2+)]_i濃度,進而激活CaMKII-PI3K/Akt-FoxO1/AS60信號通路,最終促進pBMSCs成脂分化和葡萄糖吸收。以上研究結(jié)果揭示了胞外鈣離子對豬BMSCs增殖和成脂分化的影響及其作用機制,同時為營養(yǎng)調(diào)控動物脂肪沉積、提高肉品質(zhì)提供重要的科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

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本文編號：1161549