本文關(guān)鍵詞：歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗規(guī)�；苽浼捌涿庖哐芯�

  更多相關(guān)文章： 歐洲型PRRSV PCV2 生物反應(yīng)器 微載體 免疫原性

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome,PRRS)是一種感染率高的豬傳染病,嚴重影響著世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)。PRRS病毒分為歐洲型PRRSV(基因1型)以及美洲型PRRSV(基因2型),二者基因同源性相差40%左右。豬繁殖與呼吸綜合征臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙,斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長遲緩以及死亡率增加。世界上很多國家一直應(yīng)用弱毒疫苗和滅活疫苗來預(yù)防PRRSV。但是,弱毒疫苗的應(yīng)用,易造成病毒返祖,滅活疫苗則免疫原性一般很難有效的預(yù)防PRRSV。因此針對具有基因多樣性特點的PRRSV,需要研發(fā)出一種安全有效的PRRS疫苗。我國PRRSV主要流行毒株為美洲型高致病性毒株,但近幾年在我國多個省份相繼分離到了歐洲型PRRS毒株,歐洲型PRRSV的出現(xiàn)應(yīng)該引起我們的關(guān)注。我國目前市面上的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為美洲型,美洲型的PRRS疫苗對歐洲型PRRSV基本無交叉免疫保護性,因此需要研發(fā)出一種安全有效的歐洲型PRRS疫苗。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。主要分為PCV-1和PCV-2兩種血清型。加拿大1991年在世界范圍內(nèi)首次報道PMWS,到目前為止該病現(xiàn)已波及世界上很多國家,是被全球公認的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一,在中國PCV2在豬群中流行也十分嚴重。因此,研發(fā)一種安全有效的疫苗是解決PCV2流行問題的關(guān)鍵。研究目的:本研究開展了歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗的制備和免疫研究,通過利用微載體生物反應(yīng)器技術(shù)制備實驗室構(gòu)建的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗,并通過豬體免疫實驗對其免疫效果進行評價。研究內(nèi)容:1.篩選出增殖能力強的種子細胞及種毒,建立種子細胞庫及種病毒庫。2.通過細胞條件、感染條件、生產(chǎn)參數(shù)進行重組痘苗病毒疫苗制備條件優(yōu)化。3.通過微載體生物反應(yīng)器技術(shù)建立分批式培養(yǎng)、半間歇式培養(yǎng)、灌注式培養(yǎng)三種生產(chǎn)工藝,進行歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗的制備。4.利用微載體生物反應(yīng)器制備的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗進行豬體免疫研究。研究方法:1.種子細胞庫及種毒庫建立通過細胞傳代、細胞感染、滴度測定等方法,篩選出安全無致瘤性的bhk-21細胞及適合生產(chǎn)的歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒rvtt-orf2-euo3o5毒株,建立種子細胞庫及種毒庫。2.重組痘苗病毒疫苗制備條件優(yōu)化通過細胞條件優(yōu)化和感染條件優(yōu)化確定一套可用于細胞增殖和病毒擴增的生產(chǎn)控制條件。再通過研究溫度、ph、轉(zhuǎn)速等不同的調(diào)控參數(shù)在培養(yǎng)過程中對細胞和病毒收益的影響,進一步優(yōu)化調(diào)控參數(shù),為大規(guī)模細胞培養(yǎng)和病毒增殖提供有效的參數(shù)。3.歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒候選疫苗制備通過結(jié)合重組痘苗病毒疫苗優(yōu)化后的數(shù)據(jù)結(jié)果進行生物反應(yīng)器生產(chǎn)工藝流程的制定,并通過生產(chǎn)過程中葡萄糖和乳酸中間的關(guān)系對細胞增殖的影響選出最佳生產(chǎn)工藝。并對生物反應(yīng)器所制備疫苗進行質(zhì)量檢測,疫苗品質(zhì)是否符合《中華人民共和國獸藥典》第三部的要求。4.歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒候選疫苗豬體免疫研究通過利用生物反應(yīng)器制備的以歐洲型prrsv經(jīng)典株lv株的orf3和orf5基因以及pcv2的orf2基因為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組痘苗病毒(rvtt-orf2-eu-o3o5)疫苗進行豬體免疫實驗,檢測其各項免疫指標,分析重組痘苗病毒疫苗的免疫效果。研究結(jié)果:1.通過致瘤性實驗,證明了bhk-21種細胞的安全、純凈;通過種子細胞、種毒的產(chǎn)毒比較,驗證了種細胞的增殖及產(chǎn)毒優(yōu)勢,達到了預(yù)期的目的;通過pcr鑒定、wb鑒定,證明了歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒,可以表達外源基因,形態(tài)上與天然痘苗病毒無差異;通過篩選,成功建立了種子細胞庫和種毒庫,凍存種子細胞16株,凍存種毒10株。2.通過細胞條件優(yōu)化,最終確定以10%血清(hyclone)濃度的dmem培養(yǎng)基進行細胞階段的培養(yǎng)基;通過感染條件優(yōu)化,最終確定以0.1MOI的感染劑量和2%血清濃度的維持液作為病毒感染階段的感染條件;通過生產(chǎn)參數(shù)優(yōu)化,最終確定細胞增殖階段參數(shù):溫度為37℃、pH=7.3及M=80r/min。感染階段參數(shù):溫度為35℃、pH=7.1及M=40r/min。3.通過利用微載體生物反應(yīng)器技術(shù)建立了分批式培養(yǎng)、半間歇式培養(yǎng)和灌注式培養(yǎng)三種生產(chǎn)方式;根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)對細胞增殖的影響,確定灌注式培養(yǎng)是最適合疫苗制備的生產(chǎn)工藝;本實驗制備的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗,質(zhì)量符合《中華人民共和國獸藥典》第三部疫苗標準。4.通過豬體免疫實驗,歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒候選疫苗免疫組,均能在35d能夠有效的誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答,且中和抗體效價可達1:18.表明重組痘病毒疫苗可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答;歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒候選疫苗免疫組細胞因子,T淋巴細胞增殖實驗等結(jié)果顯著高于野毒及PBS對照組,表明重組痘病毒疫苗可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答;攻毒保護實驗中,疫苗免疫組體溫顯著低于對照組,且體溫均低于40℃無發(fā)熱臨床癥狀表現(xiàn)。病毒載量和病理切片結(jié)果表明在病毒入侵時重組痘苗病毒疫苗可以提供良好保護性。研究結(jié)論:1.成功篩選出種子細胞和種毒,并建立了種子細胞庫及種病毒庫。2.通過細胞條件優(yōu)化、病毒條件優(yōu)化及生產(chǎn)參數(shù)優(yōu)化,確定生產(chǎn)過程中最優(yōu)收益條件及參數(shù)。3.建立了三種生產(chǎn)工藝,通過培養(yǎng)中各物質(zhì)之間消耗代謝關(guān)系,確定灌注式生產(chǎn)工藝為生產(chǎn)方式進行疫苗制備。4.通過疫苗豬體免疫實驗,結(jié)果顯示疫苗可以刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應(yīng)答,并在病毒入侵機體時提供良好的保護。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28

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