本文關(guān)鍵詞：上海地區(qū)PCV2分子流行病學(xué)及PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的磷酸化蛋白組學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： PCV2 豬肺泡巨噬細(xì)胞 磷酸化蛋白質(zhì)組 遺傳變異

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus diseases,PCVD)的主要病原,嚴(yán)重危害豬群健康的全球性重要的傳染病。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外有關(guān)PCV2感染報(bào)道日益增多,引起人們廣泛的關(guān)注。為了了解上海地區(qū)PCV2流行狀況,我們對(duì)PCV2開(kāi)展了流行病學(xué)調(diào)查,并對(duì)PCV2進(jìn)行了遺傳變異分析。我國(guó)大多數(shù)地區(qū)豬群中PCV2的感染十分普遍,PCV2可能是一種豬場(chǎng)常在病原體,其中PCV2與其他病原體共感染現(xiàn)象非常嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)借助蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化修飾手段先從體外實(shí)驗(yàn)分析PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞系(porcine alveolar macrophage,PAM)后細(xì)胞因子表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)變化,探討PCV2感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)理,具體研究?jī)?nèi)容如下:1.PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查2014年到2015年初期間,從上海浦東、閔行、嘉定、奉賢的所有規(guī)模化豬場(chǎng)中的疑似PCVD患病豬群和正常豬群中采集組織樣品,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法,分別檢測(cè)PCV1、PCV2。結(jié)果表明,PCV2感染陽(yáng)性率為64.20%,從陽(yáng)性病料中測(cè)序鑒定到10條PCV2序列,對(duì)其ORF2基因進(jìn)行測(cè)序及分子遺傳演化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上海地區(qū)發(fā)病豬群中PCV2d為優(yōu)勢(shì)流行基因型,在同一豬場(chǎng)中同時(shí)存在PCV2d、PCV2b及PCV2e。表明PCV2不同基因型毒株在豬體內(nèi)存在序列漂移現(xiàn)象。PCV2的ORF2同源性分析表明,本研究中的10株P(guān)CV2毒株之間同源性為90.3%~99%;10株P(guān)CV2毒株與國(guó)內(nèi)毒株間同源性高達(dá)90.3%~99.3%,與國(guó)外毒株間同源性為90.0%~99.7%。表明國(guó)內(nèi)、外PCV2毒株序列沒(méi)有明顯的地域差異。2.PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究本文分別利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和間接免疫熒光技術(shù)(indirect immunoinfluscent assay,IFA)檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PCV2的病毒滴度和不同細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β)的mRNA表達(dá)水平,以此為依據(jù),確定PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)的早期和晚期時(shí)間點(diǎn),分別是24 h和60 h。利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantificationI,iTRAQ)定量組學(xué)的方法分別在PCV2感染后的24 h和60 h時(shí)研究磷酸化蛋白質(zhì)的變化。本次研究中,我們鑒定了925獨(dú)特的磷酸化蛋白,24 h和60 h鑒定到692個(gè)和691個(gè)磷酸化蛋白,這些磷酸化蛋白的變化為探究PCV2免疫抑制和致病機(jī)制提供了大量信息。分析磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)PCV2在感染宿主細(xì)胞時(shí),抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)自噬,可能是由于Hippo和Notch信號(hào)通路以及磷酸肌醇信號(hào)的激活,導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)激酶發(fā)生變化�；プ骶W(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)這些PCV2誘導(dǎo)而產(chǎn)生變化的磷酸化蛋白涉及到的生物過(guò)程包括細(xì)胞裝配和組成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白合成、核酸代謝、新陳代謝、細(xì)胞活動(dòng)等。這些信號(hào)通路和功能網(wǎng)絡(luò)分析有助于我們進(jìn)一步理解PCV2的致病機(jī)理,本研究為PCV2感染引起的免疫抑制和致病機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：PCV2 豬肺泡巨噬細(xì)胞 磷酸化蛋白質(zhì)組 遺傳變異
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-22
• 1.1 豬圓環(huán)病毒2型的發(fā)現(xiàn)及其流行病學(xué)發(fā)展15-16
• 1.1.1 PCV2的發(fā)現(xiàn)15
• 1.1.2 PCV2的流行與分布15
• 1.1.3 PCV2基因型分類和變化15-16
• 1.2 PCV2引起的相關(guān)疾病16-19
• 1.2.1 PMWS16
• 1.2.2 PRDC16-17
• 1.2.3 PDNS17
• 1.2.4 母豬繁殖障礙17
• 1.2.5 CT17-18
• 1.2.6 PNP18
• 1.2.7 與豬其他病原體并發(fā)感染18-19
• 1.3 PCV2致病機(jī)理19-20
• 1.3.1 PCV2免疫抑制機(jī)理19
• 1.3.2 PCV2感染與凋亡19-20
• 1.4 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)在病毒感染中的應(yīng)用20-22
• 1.4.1 蛋白質(zhì)磷酸化修飾簡(jiǎn)介20
• 1.4.2 病毒感染與磷酸化作用研究進(jìn)展20-22
• 第二章 上海地區(qū)PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查22-36
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 試劑22
• 2.1.2 病料22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 病料的處理23
• 2.2.2 提取病料組織中病毒的DNA/RNA23
• 2.2.3 病料中PCV1和PCV2檢測(cè)23-24
• 2.2.4 PCV2-ORF2基因擴(kuò)增24-25
• 2.2.5 PCV2-ORF2 PCR產(chǎn)物的回收純化25
• 2.2.6 回收PCR產(chǎn)物連接PMD18-T載體25
• 2.2.7 制備感受態(tài)細(xì)胞25-26
• 2.2.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞26
• 2.2.9 質(zhì)粒小量的制備26-27
• 2.2.10 質(zhì)粒PCR電泳鑒定27
• 2.2.11 序列測(cè)定與遺傳變異分析27
• 2.3 結(jié)果27-34
• 2.3.1 病料中PCV1和PCV2基因擴(kuò)增結(jié)果27-28
• 2.3.2 PCV2-ORF2基因擴(kuò)增結(jié)果28-29
• 2.3.3 PCV2-ORF2-pMD-18T重組質(zhì)粒的PCR鑒定29
• 2.3.4 PCV2-ORF2測(cè)序結(jié)果29-30
• 2.3.5 PCV2-ORF2核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析30-33
• 2.3.6 PCV2-ORF2編碼的氨基酸序列分析33-34
• 2.3.7 PCV2-ORF2核苷酸與氨基酸序列同源性分析34
• 2.4 討論34-36
• 第三章 PCV2感染豬肺泡巨噬細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究36-53
• 3.1 材料36
• 3.1.1 毒株、質(zhì)粒和細(xì)胞36
• 3.1.2 主要試劑36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí)間點(diǎn)的確定37-38
• 3.2.1.1 病毒接種37
• 3.2.1.2 間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)PCV237
• 3.2.1.3 SYBR Green實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的變化37-38
• 3.2.4 細(xì)胞樣品制備38
• 3.2.5 蛋白提取和酶解38-39
• 3.2.6 肽段標(biāo)記和磷酸化肽段富集39
• 3.2.7 LC?MS/MS分析39
• 3.2.8 數(shù)據(jù)分析39
• 3.2.9 生物信息學(xué)分析39-40
• 3.3 結(jié)果40-51
• 3.3.1 PCV2檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的確定40-41
• 3.3.1.1 IFA檢測(cè)PCV2在PAM細(xì)胞系上的增殖40
• 3.3.1.2 SYBR Green實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10的變化40-41
• 3.3.2 利用ITRAQ LC?MS/MS對(duì)PCV2感染的PAM細(xì)胞進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的定量分析41-42
• 3.3.3 亞細(xì)胞定位和功能注釋分析42-45
• 3.3.4 磷酸化蛋白參與信號(hào)通路分析45-47
• 3.3.5 磷酸化蛋白間相互分析47-51
• 3.4 討論51-53
• 第四章 全文結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 附錄 160-62
• 附錄 262-74
• 致謝74-75
• 作者簡(jiǎn)歷75

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王海燕;劉文博;高崧;劉秀梵;;載體表達(dá)的siRNA分子對(duì)豬圓環(huán)病毒2型復(fù)制的抑制作用[J];微生物學(xué)報(bào);2008年11期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 李文潔;我國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）分子流行病學(xué)調(diào)查[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

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本文編號(hào)：1105456