禽呼腸孤病毒感染對(duì)體外細(xì)胞和SPF雞Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄影響的初步研究
本文關(guān)鍵詞:禽呼腸孤病毒感染對(duì)體外細(xì)胞和SPF雞Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄影響的初步研究
更多相關(guān)文章: 禽呼腸孤病毒 雞Toll樣受體 real-time PCR 轉(zhuǎn)錄水平
【摘要】:禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)是重要的家禽病原體之一,可導(dǎo)致雞病毒性關(guān)節(jié)炎、免疫抑制、呼吸障礙綜合征等,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。前人研究表明, ARV的研究方向有病毒檢測(cè)方法的建立、病原體的分離鑒定、病毒基因組的測(cè)序等幾個(gè)方面,然而對(duì)于ARV在分子致病機(jī)制方面的研究報(bào)道并不多見(jiàn)。為了能夠有效防控ARV的感染,因此需要進(jìn)一步對(duì)禽呼腸孤病毒進(jìn)行分子致病機(jī)制方面的研究。雞Toll樣受體是天然免疫分子,能識(shí)別病原相關(guān)分子模式在機(jī)體天然免疫系統(tǒng)起防御作用,同時(shí)還能啟動(dòng)獲得性免疫,是連接機(jī)體天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫的重要介質(zhì)。目前已證明雞Toll樣受體在禽流感感染、雞傳染性法氏囊病毒感染、馬立克氏病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染等致病過(guò)程中占有重要作用,但有關(guān)ARV感染導(dǎo)致機(jī)體雞Toll樣受體的轉(zhuǎn)錄量變化和免疫抑制的致病機(jī)制少有報(bào)道。為探討ARV感染對(duì)雞Toll樣受體ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄的影響,本研究首先建立了雞ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21的mRNA的SYBR Green II實(shí)時(shí)熒光染料相對(duì)定量PCR檢測(cè)方法,體內(nèi)外試驗(yàn)分別用ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株S1133株感染7日齡SPF雛雞和體外雞胚成纖維細(xì)胞(CEF), real-time PCR方法檢測(cè)與分析ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21在體外CEF細(xì)胞和SPF雞體內(nèi)不同組織器官(外周血淋巴細(xì)胞、肝臟、心臟、胸腺、脾臟、法氏囊和關(guān)節(jié))中不同試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量變化情況。根據(jù)GenBank上公布的雞ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21和內(nèi)參基因(GAPDH)序列,運(yùn)用生物軟件設(shè)計(jì)特異性引物并送公司合成。抽提SPF雞脾臟的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模版構(gòu)建的重組質(zhì)粒,繪制雞Toll樣受體SYBR Green Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光染料相對(duì)定量PER標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明所檢測(cè)的受體基因的溶解曲線(xiàn)均為單峰,擴(kuò)增效率接近100%,線(xiàn)性相關(guān)性大于0.99,基因檢測(cè)下限達(dá)到熒光定量檢測(cè)要求。說(shuō)明本研究建立的Toll樣受體檢測(cè)方法可以應(yīng)用于熒光定量檢測(cè)。運(yùn)用已建立雞Toll樣受體的熒光定量PER檢測(cè)方法,檢測(cè)ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株S1 133感染雞胚成纖維細(xì)胞CEF后,ARV結(jié)構(gòu)蛋白σC和ChTLR3、ChTLR5、 ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄水平。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),ARV感染CEF后其結(jié)構(gòu)蛋白于48h時(shí)相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào)并且達(dá)到峰值(P0.01);同時(shí),感染CEF中的ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量發(fā)生顯著變化,在感染72h內(nèi)各個(gè)受體的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量呈波浪式變化。ChTLR3 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染后24h上調(diào)6.5倍;ChTLR5 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量分別在感染前期(10h)和后期(72h)分別達(dá)到峰值,其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量分別上調(diào)20.67倍和18.38倍;ChTLR7 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染后6h達(dá)到峰值,相對(duì)轉(zhuǎn)錄量為對(duì)照組的9.22倍;ChTLR15 mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染12h呈現(xiàn)峰值,相對(duì)轉(zhuǎn)錄量上調(diào)14.23倍;ChTLR21mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染10h后上調(diào)13.74倍。五個(gè)不同滴度的ARV病毒感染CEF24h后,ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與病毒滴度均呈正線(xiàn)性相關(guān)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明: ARV感染后可誘導(dǎo)CEF中ChTLR3、 ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15、ChTLR21的mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化,提示可能與禽呼腸孤病毒的復(fù)制和致病機(jī)制相關(guān)。動(dòng)物試驗(yàn)7日齡SPF經(jīng)足墊途徑注射ARV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒S1133株,real-time染料相對(duì)定量PCR方法分別檢測(cè)感染雞后不同組織器官(外周血淋巴細(xì)胞、肝臟、心臟、胸腺、脾臟、法氏囊和關(guān)節(jié))中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量變化情況。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),ARV感染可引起上述雞Toll樣受體mRNA在不同試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著的變化,以此推測(cè)上述Toll樣受體相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染SPF雞后引起的不同組織器官損傷有關(guān)。其中ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA在關(guān)節(jié)中相對(duì)轉(zhuǎn)錄量發(fā)生顯著變化,ARV感染后第3d相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著上調(diào),隨后第14d相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著下調(diào)(P0.05 or P0.01),推測(cè)這些受體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量變化可能與ARV感染導(dǎo)致的關(guān)節(jié)病變有關(guān)。心臟中ChTLR3、ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第3d顯著上調(diào)(P0.01 or P0.05),推測(cè)以上受體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的改變可能與ARV感染引起的心臟損傷相關(guān)聯(lián)。肝臟中ChTLR3基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著上調(diào)(P0.05),而ChTLR7、ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第3d顯著上調(diào)(P0.05 or P0.01),推測(cè)它們相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染所致的肝臟臟損傷相關(guān)。ChTLR3、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在不同免疫器官(胸腺、脾臟和法氏囊)中均有不同程度的上調(diào),其中免疫器官中ChTLR3基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第1 d顯著上調(diào)(P0.05 or P0.01);脾臟中ChTLR7基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第5d顯著上調(diào)(P0.01),ChTLR7基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在胸腺和法氏囊中在免疫器官中在感染第1d顯著上調(diào)(P0.05),其他受體在不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)轉(zhuǎn)錄量也有明顯的變化,推斷免疫器官中各個(gè)受體相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV引起的免疫抑制有關(guān)。外周血淋巴細(xì)胞中ChTLR3和ChTLR21基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第1d顯著下調(diào),前者至第7d顯著下調(diào)到最低值,而后者開(kāi)始慢慢上調(diào)(P0.05 or P0.01);ChTLR7基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量在感染第7d顯著上調(diào)并達(dá)到峰值(P0.01);其他受體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量也有明顯的變化,提示它們相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化可能與ARV感染所致外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。本研究完成了禽呼腸孤病毒感染的體外雞胚成纖維細(xì)胞和SPF雞組織器官以及外周血淋巴細(xì)胞中雞Toll樣受體(ChTLR3、ChTLR5、ChTLR7、 ChTLR15和ChTLR21)基因的mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量動(dòng)態(tài)的檢測(cè)結(jié)果,從體外細(xì)胞和體內(nèi)SPF雞體兩個(gè)試驗(yàn)?zāi)P头治隽瞬煌uToll樣受體在ARV感染后相對(duì)表達(dá)量的變化,旨在更好的研究禽呼腸孤病毒的致病機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】:禽呼腸孤病毒 雞Toll樣受體 real-time PCR 轉(zhuǎn)錄水平
【學(xué)位授予單位】:廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類(lèi)號(hào)】:S858.31
【目錄】:
- 摘要4-8
- ABSTRACT8-13
- 論文中的英文縮寫(xiě)及中文對(duì)照表13-17
- 第一章 文獻(xiàn)綜述17-25
- 1.1 禽呼腸孤病毒研究的進(jìn)展17-20
- 1.1.1 禽呼腸孤病毒的簡(jiǎn)介17-18
- 1.1.2 ARV的形態(tài)和結(jié)構(gòu)18-19
- 1.1.3 ARV的增殖特性19
- 1.1.4 禽呼腸孤病毒的診斷與防治19-20
- 1.2 雞Toll樣受體的研究進(jìn)展20-22
- 1.2.1 Toll樣受體的概念20
- 1.2.2 Toll樣受體的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)20-21
- 1.2.3 雞Toll樣受體的功能21-22
- 1.3 SYBR Green Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR22-23
- 1.3.1 SYBR Green Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR原理22-23
- 1.3.2 SYBR Green Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR應(yīng)用23
- 1.4 本課題研究的意義23-25
- 第二章 雞TLR3、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立25-37
- 2.1 材料與方法26-30
- 2.1.1 主要儀器與試劑26
- 2.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成26-27
- 2.1.3 SPF雞脾臟RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄27-28
- 2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品制備28-29
- 2.1.5 目的基因條件的優(yōu)化29
- 2.1.6 目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)試驗(yàn)29
- 2.1.7 溶解曲線(xiàn)試驗(yàn)29-30
- 2.1.8 敏感性試驗(yàn)30
- 2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)30
- 2.2 結(jié)果30-36
- 2.2.1 RNA抽提結(jié)果30-31
- 2.2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備結(jié)果31
- 2.2.3 real-time PCR條件優(yōu)化結(jié)果31-32
- 2.2.4 各個(gè)目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作結(jié)果32-33
- 2.2.5 溶解曲線(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果33-34
- 2.2.6 各個(gè)基因的敏感性試驗(yàn)結(jié)果34-36
- 2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果36
- 2.3 討論36-37
- 第三章 禽呼腸孤病毒感染體外雞胚成纖維細(xì)胞后Toll樣受體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化37-45
- 3.1 材料與方法39-41
- 3.1.1 病毒39
- 3.1.2 主要試驗(yàn)試劑和儀器39
- 3.1.3 細(xì)胞的制備與培養(yǎng)39
- 3.1.4 呼腸孤病毒TCID50測(cè)定39
- 3.1.5 呼腸孤病毒感染方法39-40
- 3.1.6 收集細(xì)胞樣品40
- 3.1.7 CEF細(xì)胞的RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄40
- 3.1.8 樣品測(cè)定40
- 3.1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析40-41
- 3.2 結(jié)果41-44
- 3.2.1 ARV病毒結(jié)構(gòu)蛋白6C基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄變化41
- 3.2.2 ARV S1133株感染CEF后雞Toll樣受體的轉(zhuǎn)錄水平變化41-43
- 3.2.3 不同接種劑量ARV感染CEF細(xì)胞24h后雞Toll樣受體的表達(dá)變化43-44
- 3.3 討論44-45
- 第四章 ARV感染對(duì)SPF雞組織器官中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響45-70
- 4.1 材料與方法47-48
- 4.1.1 主要試劑和儀器47
- 4.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物47
- 4.1.3 ARV感染SPF雞試驗(yàn)47
- 4.1.4 SPF雞剖檢及組織樣品采集47
- 4.1.5 采集樣品的RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄47-48
- 4.1.6 試驗(yàn)樣品的Real-time PCR測(cè)定48
- 4.1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析48
- 4.2 結(jié)果48-67
- 4.2.1 SPF雞感染呼腸孤病毒后的臨床表現(xiàn)48-54
- 4.2.1.1 SPF雞體重及各個(gè)器官的變化情況48-53
- 4.2.1.2 SPF雞感染ARV后各個(gè)器官的臨床表現(xiàn)53-54
- 4.2.2 關(guān)節(jié)中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化54-56
- 4.2.3 心臟中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化56-58
- 4.2.4 肝臟中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化58-60
- 4.2.5 脾臟中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化60-62
- 4.2.6 胸腺中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化62-64
- 4.2.7 法氏囊中5種雞Toll樣受體mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化64-65
- 4.2.8 外周血淋巴細(xì)胞中5種雞Toll樣受體基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量的變化65-67
- 4.3 討論67-70
- 結(jié)論70-71
- 參考文獻(xiàn)71-76
- 致謝76-77
- 個(gè)人簡(jiǎn)歷77
- 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況77
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9 馬利;禽呼腸孤病毒和傳染性支氣管炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年
10 尹春紅;兩株禽呼腸孤病毒分離株生物學(xué)特性分析及間接ELISA方法的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年
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