本文關(guān)鍵詞：抗豬流行性腹瀉病毒豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構(gòu)建、表達(dá)及活性鑒定

  更多相關(guān)文章： 豬流行性腹瀉 單鏈抗體 基因工程 SOE-PCR Western-Blot

【摘要】：目前,市場上預(yù)防豬流行性腹瀉的主要疫苗均為弱毒苗和滅活苗,2010年冬季以來,豬流行性腹瀉在我國又開始了爆發(fā)流行,即使是商品化的疫苗也難以快速控制該病的發(fā)展,說明主動(dòng)免疫在免疫系統(tǒng)發(fā)育不健全的仔豬上難以發(fā)揮保護(hù)作用,因此,利用基因工程手段研發(fā)新型重組抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫就成為了另外一個(gè)選擇。本文在前人開發(fā)的抗PEDV雜交瘤細(xì)胞2D1的基礎(chǔ)上,通過提取雜交瘤細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得全套cDNA,以此為模板,利用17對(duì)引物擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因,利用19對(duì)引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)基因,篩選出2株VH序列和1株VL序列以及特異性擴(kuò)增抗體可變區(qū)引物;另一方面,將原核表達(dá)的PEDV S1蛋白免疫昆明白鼠,獲得陽性抗血清,提取脾細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄全套cDNA,以此為模板,利用篩選出的特異性引物擴(kuò)增抗體VH序列和VL序列,其中一株重鏈可變區(qū)單克隆SH2與雜交瘤細(xì)胞中抗體重鏈可變區(qū)基因序列VH5 100%相同,一株輕鏈可變區(qū)單克隆SL2與雜交瘤細(xì)胞中抗體輕鏈可變區(qū)基因序列VL匹配率達(dá)到97.18%,由此可以確定抗PEDV抗體的VH序列(366bp)和VL序列(354bp);與此同時(shí),通過提取豬脾細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄全套cDNA,以此為模板,利用特異性引物擴(kuò)增獲得抗體Fc序列(363bp);通過SOE-PCR方法拼接得到單鏈抗體scFv(765bp)和scFv-Fc(1128bp),經(jīng)過IgBlast分析后,兩種單鏈抗體均具有典型結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建原核表達(dá)載體pEASY-scFv和pET28a-sc Fv-Fc,通過原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分別表達(dá),理論分子量分別為32KDa和45.8kDa,利用SDS-PAGE和Western-Blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,通過間接Elisa鑒定該重組蛋白與PEDV的結(jié)合活性;最后,利用HRP anti-lebeled 6×His和HRP Goat anti-Swine兩種抗體對(duì)scFv和sc Fv-Fc進(jìn)行雜交。結(jié)果表明,通過原核表達(dá)產(chǎn)生的兩種重組抗體均具有抗原結(jié)合活性,包含F(xiàn)c段的sc Fv-Fc具有能被Goat anti-Swine抗體識(shí)別的特性,該研究為針對(duì)PEDV的重組抗體的研究奠定了理論基礎(chǔ),使用豬源Fc段對(duì)單鏈抗體的種屬特異性進(jìn)行了改造,具有較為深遠(yuǎn)的實(shí)際應(yīng)用意義。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉 單鏈抗體 基因工程 SOE-PCR Western-Blot
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 致謝4-8
• 中文摘要8-9
• 英文縮略詞表9-10
• 1 文獻(xiàn)綜述10-16
• 1.1 豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展10-11
• 1.1.1 豬流行性腹瀉概述10
• 1.1.2 豬流行性腹瀉病毒概述10
• 1.1.3 PEDV疫苗的研究進(jìn)展10-11
• 1.1.4 疫苗在PEDV防治過程中的不足11
• 1.2 單鏈抗體研究進(jìn)展11-16
• 1.2.1 免疫球蛋白簡介11-12
• 1.2.2 抗體的發(fā)展歷程12-13
• 1.2.3 單鏈抗體簡介13-14
• 1.2.4 單鏈抗體在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)14
• 1.2.5 單鏈抗體在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)14
• 1.2.6 豬源化嵌合單鏈抗體14-16
• 2 引言16-17
• 3 材料與方法17-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料17-20
• 3.1.1 菌株、載體、質(zhì)粒及相關(guān)蛋白17
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)相關(guān)動(dòng)物及組織17
• 3.1.3 雜交瘤細(xì)胞17
• 3.1.4 主要試劑及試劑盒17-18
• 3.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備18-19
• 3.1.6 常用溶液配方19-20
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法20-43
• 3.2.1 從雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因20-26
• 3.2.2 小鼠免疫及抗體基因的克隆26-28
• 3.2.3 豬IgG Fc的克隆28-29
• 3.2.4 單鏈抗體基因scFv的構(gòu)建、表達(dá)及檢測29-38
• 3.2.5 豬源化單鏈抗體基因scFv-Fc的構(gòu)建、表達(dá)及檢測38-42
• 3.2.6 Western-Blot反應(yīng)檢測scFv蛋白和sc Fv-Fc蛋白的種屬特異性42-43
• 4 結(jié)果與分析43-62
• 4.1 從雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因43-47
• 4.1.1 雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA43
• 4.1.2 擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)43-44
• 4.1.3 擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)44-45
• 4.1.4 抗PEDV抗體重鏈可變區(qū)基因的序列測定及分析45-46
• 4.1.5 抗PEDV抗體輕鏈可變區(qū)基因的序列測定及分析46-47
• 4.2 從免疫小鼠脾臟中擴(kuò)增抗體基因47-50
• 4.2.1 小鼠免疫47
• 4.2.2 小鼠脾臟總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA47-48
• 4.2.3 確定抗PEDV抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因序列48-50
• 4.3 單鏈抗體基因scFv的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定50-55
• 4.3.1 SOE-PCR法構(gòu)建scFv50-51
• 4.3.2 表達(dá)載體pEASY-scFv構(gòu)建51
• 4.3.3 表達(dá)載體pEASY-scFv誘導(dǎo)表達(dá)51
• 4.3.4 IPTG誘導(dǎo)劑量與表達(dá)效率的關(guān)系51-52
• 4.3.5 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間與表達(dá)效率的關(guān)系52-53
• 4.3.6 IPTG誘導(dǎo)溫度與表達(dá)效率的關(guān)系53
• 4.3.7 Western-Blot檢測目的蛋白53
• 4.3.8 目的蛋白的純化53-54
• 4.3.9 Elisa檢測54-55
• 4.4 豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定55-60
• 4.4.1 SOE-PCR法構(gòu)建scFv-Fc55
• 4.4.2 pMD19-T-scFv-Fc和pET28a雙酶切55-56
• 4.4.3 菌液PCR檢測及單酶切鑒定56-57
• 4.4.4 IPTG誘導(dǎo)劑量與表達(dá)效率的關(guān)系57
• 4.4.5. IPTG誘導(dǎo)時(shí)間與表達(dá)效率的關(guān)系57-58
• 4.4.6 IPTG誘導(dǎo)溫度與表達(dá)效率的關(guān)系58-59
• 4.4.7 確定目的蛋白表達(dá)形式59
• 4.4.8 Western-Blot檢測目的蛋白59
• 4.4.9 目的蛋白純化59-60
• 4.4.10 Elisa檢測60
• 4.5 Western-Blot檢測scFv和scFv-Fc單鏈抗體60-62
• 5 小結(jié)與討論62-64
• 5.1 小結(jié)62
• 5.2 討論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 附錄:scFv-Fc基因序列70-72
• 作者讀研期間發(fā)表文章72-73
• abstract73

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本文編號(hào)：1059205