本文關(guān)鍵詞：miR-36f對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育的調(diào)控及其靶基因核酸疫苗免疫效果評(píng)價(jià)

  更多相關(guān)文章： 豬蛔蟲(chóng) microRNA 核酸疫苗 免疫保護(hù)

【摘要】：豬蛔蟲(chóng)(Ascaris suum)在分類(lèi)上屬于蛔蟲(chóng)目(Ascaridida),蛔蟲(chóng)科(Ascarididae),蛔蟲(chóng)屬(Ascaris),成蟲(chóng)寄生于豬的小腸,是豬腸道中最大的寄生線蟲(chóng),呈世界性分布。就豬蛔蟲(chóng)的危害而言,一方面,豬蛔蟲(chóng)寄生消耗宿主營(yíng)養(yǎng),數(shù)量巨大時(shí)導(dǎo)致腸道堵塞;另一方面,豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)移行會(huì)對(duì)宿主器官造成機(jī)械性損傷。雖然化學(xué)藥物可以實(shí)現(xiàn)蛔蟲(chóng)病治療,但由于長(zhǎng)期對(duì)藥物的依賴(lài)以及不科學(xué)地使用,也造成了寄生蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生以及動(dòng)物產(chǎn)品藥物殘留問(wèn)題。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品健康的要求和關(guān)注度越來(lái)越高,開(kāi)發(fā)新的、環(huán)境友好型、無(wú)殘留抗寄生蟲(chóng)藥物越發(fā)顯重要。MicroRNA(miRNA)是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)非編碼小分子RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)。研究已經(jīng)證實(shí),miRNA作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在調(diào)節(jié)寄生蟲(chóng)發(fā)育方面有著不可或缺的作用,提示我們可以從miRNA角度出發(fā),尋找防控寄生蟲(chóng)的新方法。DNA疫苗又稱(chēng)裸DNA疫苗,是將具有抗原性的蛋白基因克隆到真核表達(dá)載體,然后將此重組的DNA通過(guò)注射等方式導(dǎo)入機(jī)體內(nèi),在機(jī)體內(nèi)表達(dá)抗原蛋白,使機(jī)體獲得免疫保護(hù)的一種新型疫苗。由于DNA疫苗不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答,還能像減毒活疫苗一樣誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫,并且其安全性良好,所以近年來(lái)越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。有鑒于此,本論文工作開(kāi)展了以下兩方面的工作:1.初步評(píng)價(jià)了asu-miR-36f對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育及感染性的影響。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)豬蛔蟲(chóng)發(fā)育史miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)asu-miR-36f只在豬蛔蟲(chóng)的卵和幼蟲(chóng)期特異表達(dá),而在其他時(shí)期不表達(dá),表明此miRNA在豬蛔蟲(chóng)的早期發(fā)育可能有重要作用。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)、合成了miRNA模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor),并通過(guò)浸泡的方法來(lái)導(dǎo)入幼蟲(chóng)體內(nèi),檢測(cè)asu-miR-36f以及其兩個(gè)關(guān)鍵靶基因(OST48和Cyb)的表達(dá)量;然后將處理過(guò)的幼蟲(chóng)感染小鼠并進(jìn)行了幼蟲(chóng)回收和計(jì)數(shù),初步探討其對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育和感染性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):跟對(duì)照相比,抑制劑組回收幼蟲(chóng)的數(shù)量、長(zhǎng)度和寬度差異顯著,可能是由于在抑制劑的作用下,asu-miR-36f在幼蟲(chóng)體內(nèi)的水平下降,對(duì)某些靶基因的抑制作用減弱,從而對(duì)某些通路產(chǎn)生了影響,進(jìn)而對(duì)幼蟲(chóng)的發(fā)育產(chǎn)生了影響。經(jīng)過(guò)模擬物處理實(shí)驗(yàn)組的回收幼蟲(chóng)的數(shù)量、回收蟲(chóng)體的長(zhǎng)度和寬度與其他對(duì)照組相比差異不顯著,提示蟲(chóng)體內(nèi)的miRNA功能的發(fā)揮可能依賴(lài)一定的閾值限制,當(dāng)miRNA的水平高于這個(gè)閾值的時(shí)候,隨著miRNA水平的升高,miRNA的功能不再明顯加強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明通過(guò)浸泡的方法可以有效地將miRNA導(dǎo)入到線蟲(chóng)體內(nèi)。與基因槍、顯微注射等方法相比,此方法有簡(jiǎn)單易行,對(duì)蟲(chóng)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)。2.構(gòu)建pVAX-AG、pVAX-NCS核酸疫苗,評(píng)價(jià)其免疫效果。通過(guò)生物信息學(xué)分析,我們?cè)诒姸郺su-miR-36f的靶基因中選擇了兩個(gè)豬蛔蟲(chóng)特有的靶基因。將這兩個(gè)靶基因,通過(guò)PCR克隆、酶切、連接pET30a質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化DH5α、測(cè)序驗(yàn)證,并進(jìn)行BL21(DE3)原核表達(dá)后制備小鼠免疫多抗,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了pVAX 1.0重組質(zhì)粒,并通過(guò)間接免疫熒光法、Western blot證實(shí)了構(gòu)建的兩個(gè)真核重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞表達(dá),隨后進(jìn)行質(zhì)粒大量制備,通過(guò)注射方法免疫小鼠,檢測(cè)抗體水平、細(xì)胞因子水平、攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)檢測(cè)了小鼠血清中IgG抗體及IgG1、IgG2a抗體亞類(lèi)、CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-細(xì)胞含量、細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、和IL-10等,綜合評(píng)價(jià)了構(gòu)建的DNA疫苗的免疫保護(hù)性作用。結(jié)果表明:pVAX-NCS可以有效地誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,最終的減蟲(chóng)率達(dá)35.96%;而pVAX-AG也可以引起實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答,但是較弱,實(shí)驗(yàn)組的減蟲(chóng)率也不及pVAX-NCS組。提示pVAX-NCS對(duì)小鼠具有較好的免疫保護(hù)作用。綜上所述,本研究初步評(píng)價(jià)了asu-miR-36f對(duì)豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)發(fā)育的影響,并利用其靶基因成功構(gòu)建了DNA疫苗,為豬蛔蟲(chóng)DNA疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),因?yàn)閙iR-36f也發(fā)現(xiàn)存在于其它蠕蟲(chóng),故本研究構(gòu)建的DNA疫苗對(duì)于其它蠕蟲(chóng)病防控也具有良好參考價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：豬蛔蟲(chóng) microRNA 核酸疫苗 免疫保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文縮寫(xiě)對(duì)照表11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-19
• 1.1 引言12-13
• 1.2 miR-36的研究進(jìn)展13-16
• 1.2.1 miR-36基因簇特征13
• 1.2.2 miR-36的進(jìn)化及序列特征分析13-14
• 1.2.3 miR-36研究進(jìn)展14-16
• 1.2.4 小結(jié)與展望16
• 1.3 DNA疫苗研究進(jìn)展16-19
• 1.3.1 DNA疫苗簡(jiǎn)介16-17
• 1.3.2 DNA疫苗的研究進(jìn)展17-19
• 第二章 Asu-miR-36f抗豬蛔蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染的效果評(píng)價(jià)19-28
• 2.1 材料與方法19-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 2.1.2 豬蛔蟲(chóng)三期幼蟲(chóng)的培養(yǎng)19-20
• 2.1.3 儀器及試劑20
• 2.1.4 培養(yǎng)基的配制20
• 2.1.5 感染性蟲(chóng)卵的體外脫殼20-21
• 2.1.6 蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)21
• 2.1.7 asu-miR-36f模擬物, 抑制劑及其對(duì)照溶液的配制21
• 2.1.8 浸泡三期幼蟲(chóng)21
• 2.1.9 攻蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)21
• 2.1.10 檢測(cè)asu-miR-36f及OST48和Cyb表達(dá)量21-24
• 2.2 結(jié)果24-27
• 2.2.1 豬蛔蟲(chóng)受精卵培養(yǎng)至第三期幼蟲(chóng)24-25
• 2.2.2 提RNA純度檢測(cè)25
• 2.2.3 asu-miR-36f靶基因的熒光定量結(jié)果25-26
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)回收幼蟲(chóng)的數(shù)目及長(zhǎng)度和寬度結(jié)果26-27
• 2.3 討論27-28
• 第三章 pVAX -NCS、pVAX-AG的制備及免疫效果評(píng)價(jià)28-63
• 3.1 材料28-34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物28
• 3.1.2 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞28
• 3.1.3 主要試劑28-29
• 3.1.4 主要設(shè)備及儀器29
• 3.1.5 主要溶液配制29-32
• 3.1.6 培養(yǎng)基的配制32-34
• 3.2 方法34-48
• 3.2.1 豬蛔蟲(chóng)總cDNA的獲取34-35
• 3.2.2 目的基因的原核表達(dá)與陽(yáng)性血清的制備35-40
• 3.2.3 目的片段與pVAX1.0 真核表達(dá)載體的連接40-43
• 3.2.4 重組質(zhì)粒pVAX-AG、pVAX-NCS的體外表達(dá)驗(yàn)證43-44
• 3.2.5 pVAX1.0 及重組質(zhì)粒pVAX-AG、pVAX-NCS的大量制備44-45
• 3.2.6 重組質(zhì)粒的免疫效果評(píng)價(jià)45-48
• 3.3 結(jié)果48-60
• 3.3.1 AG基因和NCS基因的原核表達(dá)48-53
• 3.3.2 pVAX-AG、pVAX-NCS重組質(zhì)粒的構(gòu)建53-56
• 3.3.3 重組質(zhì)粒pVAX-AG、pVAX-NCS的體外表達(dá)驗(yàn)證56-57
• 3.3.4 重組質(zhì)粒的免疫效果評(píng)價(jià)57-60
• 3.4 討論60-63
• 第四章 全文總結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-70
• 致謝70-71
• 作者簡(jiǎn)介71-72

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