本文關(guān)鍵詞：基于qRT-PCR建立評(píng)價(jià)Ⅱ型登革病毒抗體中和效應(yīng)的微量中和試驗(yàn)方法

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【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是熱帶與亞熱帶地區(qū)發(fā)病最多、危害最大的蟲媒病毒,DENV感染一般可引起登革熱(Dengue fever,DF),嚴(yán)重的還能引起登革出血熱(dengue haemorrhagic fever,DHF)、甚至是死亡率極高的登革休克綜合征(dengue shock syndrome,DSS)。目前正在研制中的DENV疫苗種類較多,但僅有賽諾菲公司生產(chǎn)的四價(jià)疫苗于2015年12月才在墨西哥獲得批準(zhǔn)。如何準(zhǔn)確、高效地測(cè)定和評(píng)價(jià)疫苗刺激產(chǎn)生的抗體的中和效應(yīng)一直是DENV疫苗研制的難題之一。傳統(tǒng)的測(cè)定中和抗體效價(jià)的方法是中和試驗(yàn)(Neutralization Test,NT),其中空斑減少中和試驗(yàn)(Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT)一直被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低。而微量中和試驗(yàn)(Micro-neutralization Test,MN)的基本原理與PRNT相同,優(yōu)點(diǎn)在于試劑用量少、通量高。目前基于Taq Man探針的實(shí)時(shí)定量PCR(q RT-PCR)具有高特異性、高敏感性和易于高通量檢測(cè)等諸多優(yōu)勢(shì),已被廣泛用于病毒核酸的定量檢測(cè)。近年來(lái),多項(xiàng)研究表明基于q RT-PCR建立的MN方法可有效地應(yīng)用于測(cè)定病毒中和抗體效價(jià),譬如在流感病毒、CMV和SV40的中和抗體效價(jià)測(cè)定方面已經(jīng)成功建立了q RT-PCR-MN方法。本研究以DENV2為研究對(duì)象,首先建立了基于一步法Taq Man探針q RT-PCR檢測(cè)DENV2 RNA的方法并進(jìn)行優(yōu)化,然后在此基礎(chǔ)上建立了測(cè)定DENV2中和抗體效價(jià)的q RT-PCR-MN方法,并進(jìn)行了一系列條件優(yōu)化。【研究方法及結(jié)果】一、一步法Taq Man探針q RT-PCR檢測(cè)DENV2 RNA的建立及優(yōu)化首先培養(yǎng)DENV2的易感細(xì)胞C6/36,按MOI=0.1接種細(xì)胞進(jìn)行病毒大量增殖,獲得的病毒經(jīng)濃縮后保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ缓蠓謩e用空斑實(shí)驗(yàn)、TCID50檢測(cè)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)DENV2毒力進(jìn)行測(cè)定,病毒滴度分別為2×106 PFU/m L、2.53×105TCID50/m L。針對(duì)DENV2保守區(qū)域NS5基因,分別設(shè)計(jì)并合成引物和探針,PCR擴(kuò)增得到目的片段并制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)核酸電泳驗(yàn)證均與預(yù)期大小一致。將標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋作為模板,進(jìn)行一步法Taq Man探針q RT-PCR,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)一步探索PCR反應(yīng)體系中引物與探針的最佳配比。結(jié)果顯示,q RT-PCR方法檢測(cè)DENV2 RNA的線性范圍為1.0×102~108 copies/μl。與空斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,1PFU對(duì)應(yīng)大約7500 copies。計(jì)算出q RT-PCR方法檢測(cè)DENV2的靈敏度為0.013PFU,大約是空斑實(shí)驗(yàn)的75倍。二、檢測(cè)DENV2抗體中和效應(yīng)的q RT-PCR-MN方法的建立在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)q RT-PCR方法測(cè)定系列稀釋病毒感染BHK-21細(xì)胞后上清中的病毒量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化,確定最佳感染劑量為2000 TCID50和最佳檢測(cè)時(shí)間為感染后24小時(shí)。然后兩倍系列稀釋病毒感染BHK-21細(xì)胞24小時(shí)后,q RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清(未提取RNA)和細(xì)胞內(nèi)(提取RNA)的病毒量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外病毒量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.998,而且感染細(xì)胞上清中病毒量與感染劑量呈正相關(guān),r=0.982。以上結(jié)果證明了直接以感染細(xì)胞上清作為PCR檢測(cè)樣品的可行性,q RT-PCR方法可以至少辨別兩倍病毒感染劑量的變化。在此基礎(chǔ)上,建立了測(cè)定DENV2中和抗體效價(jià)的q RT-PCR-MN方法。以35份血清為研究對(duì)象時(shí),分別用PRNT和q RT-PCR-MN方法測(cè)定抗體的中和效應(yīng),兩者相關(guān)系數(shù)r=0.928;再以抗DENV2的單克隆抗體4G2為研究對(duì)象時(shí),結(jié)果顯示PRNT(IC50)為0.17μg/m L,q RT-PCR-MN(IC50)為0.10μg/m L,兩者相關(guān)系數(shù)r=0.944。以PRNT為對(duì)照,分析35份血清的檢測(cè)結(jié)果,q RT-PCR-MN的靈敏度為100%(7/7,95%CI:0.59 1.00),特異性為96.43%(27/28,95%CI:0.82 1.00),Kappa系數(shù)為0.915,說(shuō)明一致性較好。最后,我們?cè)谌_(tái)不同品牌實(shí)時(shí)定量PCR儀上用q RT-PCR-MN方法同時(shí)檢測(cè)10份血清的中和效價(jià),結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,這說(shuō)明建立的q RT-PCR-MN方法在不同儀器上具有較好的可比性,有利于各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的互認(rèn)�！窘Y(jié)論】本研究成功建立了以q RT-PCR為基礎(chǔ)的測(cè)定DENV2中和抗體效價(jià)的微量中和試驗(yàn)方法。以經(jīng)典PRNT為參照,該方法靈敏度、特異性、一致性評(píng)價(jià)均較好。本方法中以上清液直接作為PCR檢測(cè)樣品,簡(jiǎn)便快捷,而且便于自動(dòng)化檢測(cè)。不同儀器之間的檢測(cè)結(jié)果具有較好的可比性,有利于在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣。本研究不僅適用于快速有效地檢測(cè)和評(píng)價(jià)DENV疫苗刺激產(chǎn)生的中和抗體效價(jià),也適用于DENV爆發(fā)流行時(shí)的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查研究。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 微量中和試驗(yàn) qRT-PCR
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.8;R446.6
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-30
• 第一部分 一步法TaqMan探針qRT-PCR檢測(cè)DENV2方法的建立及優(yōu)化30-46
• 1 材料30-33
• 1.1 毒種和細(xì)胞株30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 常用培養(yǎng)液（基）與緩沖液31-32
• 1.4 主要儀器與器材32-33
• 2 方法33-40
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)33
• 2.2 病毒的增殖與毒力檢測(cè)33-35
• 2.3 引物設(shè)計(jì)與合成35-36
• 2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備36-38
• 2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線38-40
• 3 結(jié)果40-44
• 3.1 濃縮DENV2毒力檢測(cè)40-41
• 3.2 DENV2 NS5基因片段的PCR擴(kuò)增41-44
• 4 討論44-46
• 第二部分 檢測(cè)DENV2抗體中和效應(yīng)的qRT-PCR-MN方法的建立46-59
• 1 材料46-47
• 1.1 毒種和細(xì)胞株46
• 1.2 主要試劑與抗體46
• 1.3 常用培養(yǎng)液（基）與緩沖液46-47
• 1.4 主要儀器與器材47
• 2 方法47-50
• 2.1 引物、探針設(shè)計(jì)與合成47
• 2.2 空斑減少中和試驗(yàn)47-48
• 2.3 qRT-PCR-MN測(cè)定48-49
• 2.4 提取DENV2感染細(xì)胞內(nèi)總RNA49-50
• 2.5 不同的實(shí)時(shí)定量PCR儀比對(duì)50
• 3 結(jié)果50-56
• 3.1 最佳病毒感染劑量和感染后檢測(cè)時(shí)間的確定50-51
• 3.2 感染后細(xì)胞內(nèi)外病毒量的相關(guān)性51
• 3.3 qRT-PCR方法可以辨別病毒感染劑量?jī)杀兜淖兓?/span>51-52
• 3.4 PRNT與qRT-PCR-MN相關(guān)性分析52-54
• 3.5 qRT-PCR-MN方法的特異性、靈敏度和一致性分析結(jié)果54-55
• 3.6 qRT-PCR-MN方法在不同實(shí)時(shí)定量PCR儀上一致性的分析55-56
• 4 討論56-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果73-74
• 致謝74-75

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1 吳正青;高純;;應(yīng)用中和試驗(yàn)對(duì)乙型肝炎病毒表面抗原弱反應(yīng)性標(biāo)本確認(rèn)的臨床意義[J];實(shí)用醫(yī)技雜志;2012年07期

2 劉大英;;用敏感的中和試驗(yàn)檢測(cè)抗HIV抗體陽(yáng)性率[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1989年02期

3 鄭官增,姚蘋蘋,朱函平,朱智勇;水痘帶狀皰疹病毒蝕斑減少中和試驗(yàn)[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2001年05期

4 馬文煜,田喜燕,姜紹諄,王安定,汪美先;用微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)檢測(cè)乙型腦炎病毒抗體的探討[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1984年02期

5 安獻(xiàn)祿,李新發(fā),于文彬;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與中和試驗(yàn)檢測(cè)Ⅰ型單純皰疹病毒抗體的比較[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);1983年03期

6 邵文愛(ài),李曉眠;微量細(xì)胞中和試驗(yàn)在檢測(cè)流行性乙型腦炎抗體中的應(yīng)用[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2003年03期

7 郭中平;小鼠中和試驗(yàn)與快速熒光灶抑制試驗(yàn)檢測(cè)狂犬病抗體結(jié)果的比較[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊(cè);1986年03期

8 張曉春,蔡軍,王玉芹,王杰;中和試驗(yàn)法對(duì)健康人群麻疹抗體水平的檢測(cè)及評(píng)價(jià)[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2001年06期

9 楊英珍,金佩英,郭棋;用微量板中和試驗(yàn)細(xì)胞病變自動(dòng)定量讀數(shù)法檢測(cè)血清中柯薩奇B組病毒抗體[J];上海第一醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1985年03期

10 ;復(fù)方“乙腦”注射液對(duì)腦炎病毒的中和試驗(yàn)[J];新醫(yī)藥通訊;1971年02期

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1 滕龍;傅圣勇;;HbsAg與HbsAb中和比的初步研究[A];2004年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 北京獸藥研究所 中青;裂谷熱診斷技術(shù)[N];中國(guó)畜牧水產(chǎn)報(bào);2001年

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1 翁代慧;基于qRT-PCR建立評(píng)價(jià)Ⅱ型登革病毒抗體中和效應(yīng)的微量中和試驗(yàn)方法[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

2 金悅新;檢測(cè)豬乙腦抗體的EDⅢ抗原間接ELISA與血凝抑制和蝕斑減少中和試驗(yàn)的相關(guān)性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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