本文關鍵詞：基于環(huán)境監(jiān)測技術的人類腸道病毒區(qū)域性流行型別變遷及分子流行病學研究

  更多相關文章： 環(huán)境監(jiān)測 懸浮顆粒物 腸道病毒 山東地方株 分子流行病學

【摘要】：[背景]腸道病毒(Enteroviruses, EV)是生活在人類腸道中的一類常見病毒,多為無癥狀感染,但也可引起多種嚴重的或潛在的致死性疾病如脊髓灰質炎、腦炎、手足口病、出血性結膜炎和急性心肌炎等。近年的研究還表明,EV感染與某些慢性疾病有關,如Ⅰ型糖尿病、甲狀腺炎等。EV在世界范圍內廣泛分布,無明顯地域性差異。隨著當前各國間國際交流日益頻繁,EV流行范圍早已超過人們最初的預期,并且自然界中EV生存環(huán)境的改變很可能會加速病毒的變異。EV所致疾病主要為散發(fā)或呈地區(qū)性暴發(fā)。在非流行期,特定區(qū)域通常有幾個優(yōu)勢型別共循環(huán),而在暴發(fā)時期,往往會在同一地區(qū)分離到大量同一型別毒株。長期以來,EV感染是嚴重威脅公眾特別是兒童健康與生命安全的重大公共衛(wèi)生問題之一,加強EV分子流行病學監(jiān)測,對于預防控制EV相關疾病具有重要理論和實際意義。EV以隱性感染為主,隱性感染者可持續(xù)數(shù)周向外環(huán)境排泄大量病毒,故EV常在下水道污水、江河水中檢出,甚至污染飲用水水源。環(huán)境中的EV可以通過不同的實驗方法進行濃縮、分離及鑒定,以作為EV流行病學研究的一個補充方法,稱為環(huán)境監(jiān)測。生活污水是特定地區(qū)EV在環(huán)境中的豐富來源。環(huán)境監(jiān)測可以獲得特定地區(qū)EV的循環(huán)信息,包括有癥狀的感染和隱性感染,并有可能在人群產(chǎn)生臨床癥狀之前就在生活污水中檢出EV。EV在環(huán)境水體中廣泛存在,可在多種環(huán)境水體中被分離,但其滴度相對較低,且容易在水中懸浮物上附著,比臨床標本更難檢出。因此,環(huán)境水體標本檢測前必須進行大量水體的濃縮富集,這是決定EV能否成功分離的關鍵環(huán)節(jié)。膜吸附-洗脫法是目前實驗中應用最廣泛的濃縮方法,在病毒的環(huán)境監(jiān)測以及相關疾病的病原體檢測方面可以發(fā)揮很大作用。EV是相關領域研究的熱點之一,近年來對其進行了廣泛的流行病學及病毒學研究。目前,全球已有相當數(shù)量的國家開展環(huán)境生活污水標本的監(jiān)測研究,以了解當?shù)丶顾杌屹|炎(脊灰)病毒(Poliovirus, PV)和非脊灰腸道病毒(Non-polio Enteroviruses, NPEV)的循環(huán)狀況和開展相關研究,而國內在該領域研究較少。[研究目的]1.在前期研究的基礎上,繼續(xù)優(yōu)化環(huán)境生活污水標本中EV的濃縮分離方法,以完善方法學,提高檢測效率；探討污水標本中懸浮顆粒物對病毒吸附和分離的影響。2.通過環(huán)境監(jiān)測和病例監(jiān)測,明確2012～2014年山東地區(qū)EV型別分布、傳播和頻率,為相關疾病的流行病學研究提供支持。3.補充完善山東省環(huán)境生活污水標本EV分離株各型別的VP1區(qū)基因數(shù)據(jù)庫,研究山東省EV的基因特征和長期循環(huán)動態(tài)變化,為EV分子流行病學研究提供有價值的補充。[研究方法]1.環(huán)境監(jiān)測：本研究選擇濟南市光大污水處理廠、臨沂市首創(chuàng)水務公司作為采樣點,之后在2013年9月又納入煙臺市辛安河污水處理廠作為采樣點,分別在其生活污水的入口處采用定時采樣法采集污水標本,使用陰離子膜吸附-超聲波振蕩法進行濃縮富集,接種RD和Hep-2細胞進行病毒分離。2.病例監(jiān)測：本研究選擇山東省2012～2014年急性弛緩性麻痹(AFP)和急性腦膜炎腦炎綜合癥(AMES)兩種疾病監(jiān)測系統(tǒng)中分離的EV進行分析。3.基因擴增及型別鑒定：提取病毒RNA,使用RT-PCR擴增VP1編碼區(qū),對陽性產(chǎn)物進行序列測定。將各分離株的VP1編碼區(qū)序列通過與美國國家生物技術信息中心(NCBI)提供的數(shù)據(jù)庫比對,進而確定EV血清型別。4.生物信息學分析：使用BioEdit 7.0.9.0軟件,對生活污水和病例標本中的EV分離株以及GenBank中公布的相關EV VP1核苷酸序列進行同源性比較。使用MEGA 5.0軟件,通過鄰位法(Neighbor-joining Method)構建系統(tǒng)發(fā)生樹,建樹的可靠性通過1000Bootstrap評估。通過比較,研究山東地區(qū)EV的基因特征、變異及其進化來源。[主要結果]1.陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化：通過加標回收試驗,比較不同pH值洗脫液和不同超聲波振蕩次數(shù)對EV的回收率,確定最優(yōu)洗脫條件為：洗脫液pH為9.0,超聲振蕩時間設定為振蕩1次,持續(xù)3min。2.環(huán)境污水中懸浮顆粒物對EV的吸附作用：環(huán)境污水為酸性時,有利于EV吸附到懸浮顆粒物上；EV含量對懸浮顆粒物的吸附作用基本沒有影響。環(huán)境污水中懸浮顆粒物濃度增加,吸附到顆粒物上的病毒滴度及吸附率呈上升趨勢,吸附在其中的病毒的洗脫率呈明顯下降趨勢,總體的顆粒物回收效率在特定的濃度范圍內保持穩(wěn)定。環(huán)境污水標本中懸浮顆粒物對E-3的吸附作用較強,對E-6的吸附作用較弱。3.環(huán)境監(jiān)測和病例監(jiān)測標本的采集和病毒分離情況：2012～2014年環(huán)境監(jiān)測標本共分離到EV 2010株,包括NPEV 1468株,優(yōu)勢血清型別為E-7、CV-B5、 E-6、E-3、E-11、CV-B3; PV542株,其中發(fā)現(xiàn)1株Ⅱ型疫苗衍生株脊灰病毒(VDPV)E12-221,以及12株高變異株病毒(pre-VDPV).各市不同月份的NPEV型別譜各有不同,不同血清型別的毒株有不同的時間循環(huán)模式。AFP監(jiān)測病例共分離到NPEV119株,包括27種型別；PV 35株,未檢出VDPV毒株及PV野毒株。2014年AMES監(jiān)測病例中,收集標本798份,分離到EV 152株,陽性率為19.1%。其中,CV-B5、E6、E-30分離數(shù)目較多,占總分離數(shù)的92.8%,還分離到E-7、E-25及1例E-3與E-6的混合感染。4.EV優(yōu)勢血清型別的同源性比較和系統(tǒng)進化分析：E-7分離數(shù)目最多,分離株之間同源性較低,存在多個傳播鏈共循環(huán)。E-3核苷酸和氨基酸變異較小,在遺傳進化上較為穩(wěn)定,具有明顯的時間和地域聚集性。CV-B5分離株之間同源性較高,存在兩個傳播鏈,在山東省內傳播迅速,廣泛流行。CV-B3分離株之間核苷酸差異較小,進化分支具有明顯的時間聚集特征。E-6分離株核苷酸差異較大,保持著較快的進化速度,山東省內存在至少兩條傳播鏈的共循環(huán)。E-11分離株包括Gergory-like和Silva-like毒株,分為明顯的兩個進化分支,之間的核苷酸差異較大。[主要結論]1.根據(jù)加標回收試驗結果,通過優(yōu)化洗脫液pH值、超聲振蕩時間和次數(shù),確定了污水標本的陰離子膜吸附-超聲波振蕩法的最優(yōu)洗脫條件。2.環(huán)境污水中懸浮顆粒物對EV具有較強的吸附作用,并受到多種因素的影響,其分離型別構成與上清中差異不大,但各血清型別分離率存在差異。建立了從懸浮顆粒物中洗脫濃縮EV的方法。在今后的環(huán)境監(jiān)測中,應綜合采用污水上清和懸浮顆粒物進行分離分析。3.環(huán)境監(jiān)測和病例監(jiān)測中主要分離到的是EV-B組病毒,A組、C組病毒分離株數(shù)較少。NPEV分離株的優(yōu)勢血清型別為E-7、CV-B5、E-6、E-3、E-11、 CV-B3。各市不同月份的NPEV型別譜各有不同,不同血清型別的毒株有不同的時間循環(huán)模式。4.環(huán)境污水中分離到的PV均為疫苗株,無野病毒。國內首次從環(huán)境污水中發(fā)現(xiàn)疫苗衍生株脊灰病毒。5.山東省EV各優(yōu)勢血清型分離株進化速度較快,變異活躍,存在多條傳播鏈的共同流行,環(huán)境監(jiān)測與病例監(jiān)測優(yōu)勢株之間存在一定的遺傳進化關系。6.環(huán)境監(jiān)測對EV具有較高的敏感性,能夠獲得外環(huán)境中EV的流行情況和時間循環(huán)模式,也可以作為AFP監(jiān)測系統(tǒng)之外評估人群中PV流行的一種補充手段,為預防控制相關疾病提供科學依據(jù)。
【關鍵詞】：環(huán)境監(jiān)測 懸浮顆粒物 腸道病毒 山東地方株 分子流行病學
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.5
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 英文縮略詞說明19-21
• 前言21-29
• 1 研究背景21-26
• 1.1 概述21-22
• 1.2 EV基因組結構及進化22-23
• 1.3 EV流行病學23-24
• 1.4 環(huán)境污水標本中EV的濃縮富集和檢測24-25
• 1.5 國內外研究現(xiàn)狀25-26
• 2 研究目的與意義26-28
• 2.1 本研究的目的26-27
• 2.2 本研究的意義27-28
• 3 本研究的技術路線28-29
• 材料與方法29-40
• 1 環(huán)境污水標本的采集和濃縮富集29-31
• 1.1 主要試劑和儀器設備29
• 1.2 方法29-31
• 2 病例標本的采集與處理31-33
• 2.1 主要試劑和儀器設備31-32
• 2.2 方法32-33
• 3 細胞培養(yǎng)33-35
• 3.1 主要試劑和儀器設備33-34
• 3.2 方法34-35
• 4 病毒的分離35
• 4.1 主要試劑和儀器設備35
• 4.2 方法35
• 5 核酸提取、基因擴增及序列測定35-37
• 5.1 主要試劑和儀器設備35-36
• 5.2 研究方法36-37
• 6 瓊脂糖凝膠電泳37-38
• 6.1 主要試劑與儀器設備37-38
• 6.2 研究方法38
• 7 生物學信息分析38
• 8 質量控制38-40
• 8.1 方案設計階段38-39
• 8.2 調查實施階段39
• 8.3 數(shù)據(jù)分析階段39-40
• 結果40-84
• 1 陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化40-41
• 1.1 陰離子膜吸附中不同pH值洗脫液對EV回收率的比較40
• 1.2 不同超聲波振蕩洗脫次數(shù)對EV回收率的比較40-41
• 2 環(huán)境污水中懸浮顆粒物對EV的吸附作用41-46
• 2.1 懸浮顆粒物對EV吸附作用的影響條件41-44
• 2.2 環(huán)境標本上清和懸浮顆粒物中EV的分離情況44-46
• 3 環(huán)境監(jiān)測和病例監(jiān)測標本的采集和病毒分離情況46-59
• 3.1 環(huán)境污水標本的采集與EV分離簡況46-48
• 3.2 環(huán)境監(jiān)測和病例監(jiān)測中EV分離情況48-59
• 4 EV優(yōu)勢型別的系統(tǒng)進化分析59-84
• 4.1 E-7的同源性比較和系統(tǒng)進化分析59-64
• 4.2 E-3的同源性比較和系統(tǒng)進化分析64-68
• 4.3 CV-B5的同源性比較和系統(tǒng)進化分析68-72
• 4.4 CV-B3的同源性比較和系統(tǒng)進化分析72-76
• 4.5 E-6的同源性比較和系統(tǒng)進化分析76-80
• 4.6 E-11的同源性比較和系統(tǒng)進化分析80-84
• 討論84-97
• 1 陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化85
• 2 環(huán)境污水中懸浮顆粒物對EV的吸附作用85-86
• 3 環(huán)境污水中的病毒分離構成86-90
• 4 EV優(yōu)勢血清型別的系統(tǒng)進化分析90-97
• 4.1 E-7的同源性比較和系統(tǒng)進化分析90-91
• 4.2 E-3的同源性比較和系統(tǒng)進化分析91-92
• 4.3 CV-B5的同源性比較和系統(tǒng)進化分析92-93
• 4.4 CV-B3的同源性比較和系統(tǒng)進化分析93-94
• 4.5 E-6的同源性比較和系統(tǒng)進化分析94-95
• 4.6 E-11的同源性比較和系統(tǒng)進化分析95-97
• 結論97-98
• 本研究主要創(chuàng)新點及不足之處98-99
• 參考文獻99-107
• 致謝107-108
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文108-109
• 附件109

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 趙智嫻;丁崢嶸;張杰;湯晶晶;田炳均;;云南省外環(huán)境中人類�？虏《�7型分子流行病學分析[J];病毒學報;2014年01期

2 張之倫,劉祖義;水底淤積物中的病毒及其引起的人類疾病[J];環(huán)境與健康雜志;1988年03期

，

本文編號：698611