本文關鍵詞：聚乙二醇干擾素治療拉米夫定耐藥慢乙肝患者中耐藥毒株動態(tài)變化及其與療效的關系

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【摘要】：背景與目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染呈全球性分布,全球約有20億人既往感染過HBV,目前全球仍有超過3.5億的慢性乙肝病毒感染者。中國是HBV感染高發(fā)地區(qū),2006年中國乙型肝炎流行病學調(diào)查結果表明,我國乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率約為7.18%,其中約2000萬例為慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B virus, CHB),這些患者可以發(fā)展為失代償性肝病、肝硬化、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)等危及患者生命的疾病,因此HBV仍然是我國重要的社會公共問題之一。拉米夫定因具備有效的抑制HBV的復制的能力成為第一個用于慢性乙型肝炎治療的核苷(酸)類似物。CHB患者在LAM長期治療下可以顯著降低CHB患者血清HBV DNA水平,促進HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的發(fā)生,降低肝臟炎癥活動,從而延緩或阻止肝臟疾病的進展,減少失代償肝硬化和肝癌的發(fā)生,降低CHB患者的死亡率。由于其良好的安全性和耐受性,成為許多經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)首選用于治療慢性乙型肝炎的藥物。目前耐藥成為阻礙LAM長期治療的主要原因,耐藥在LAM治療下的1年、2年、3年、4年和5年的發(fā)生率分別為22%、38%、53%、66%和82%。耐藥發(fā)生后可導致病毒學突破或反彈,加重疾病進展,增加肝硬化以及肝癌發(fā)生的風險。因此拉米夫定治療過程中乙肝病毒耐藥的監(jiān)測以及及時的挽救治療是至關重要的。拉米夫定耐藥后的挽救治療,目前指南推薦主要是換用TDF或加用ADV。拉米夫定耐藥后加用ADV比換用ADV療效更好,并且可以減少ADV耐藥的發(fā)生率,因此指南主要推薦的拉米夫定耐藥的挽救治療策略是加用無交叉耐藥的核苷(酸)類藥挽救物。但這種挽救治療策略將意味患者需要接受長達多年的藥物治療,而且可能會導致多重耐藥的發(fā)生。聚乙二醇干擾素a-2a (Pegylated Interferon alfa-2a, Peg-IFNa-2a)是一種長效干擾素,療效優(yōu)于普通干擾素。Peg-IFN α-2a可以通過有限的治療時間在部分患者中誘導持續(xù)的免疫應答,如持續(xù)的HBeAg血清學轉(zhuǎn)換,甚至HBsAg血清學轉(zhuǎn)換。因此有研究提示Peg-IFN a-2a可能用做LAM耐藥的挽救治療。為了評價Peg-IFN a-2a挽救治療LAM耐藥患者的治療療效,在2005年至2008年間,我們進行了一項多中心、隨機、對照臨床研究。此項臨床研究用于評價Peg-IFN a-2a在HBeAg陽性的拉米夫定耐藥患者療效和安全性。結果顯示Peg-IFN a-2a在LAM耐藥患者的療效與其在初治患者療效相比,應答不佳的比例偏高,在48周停藥后,大部分患者發(fā)生了病毒學反彈。Peg-IFNαt-2a治療LAM耐藥患者應答與療效并未令人滿意,挽救治療應答不佳的原因并不清楚,主要由宿主免疫和病毒兩方面的因素導致,而這兩個因素之間又存在相互作用的關系。HBV以準種形式存在于感染者體內(nèi),感染者體內(nèi)的HBV準種因自身的突變及復制能力的差別和宿主免疫壓力的選擇作用下發(fā)生著不斷的變化,而在核苷(類)藥物的作用下,HBV耐藥突變毒株的變化可能主要由藥物的選擇和病毒自身適應性決定,但在Peg-IFN a-2a治療下并不存在對于病毒耐藥位點的選擇,因此在Peg-IFN a-2a治療下耐藥突變毒株變化可能更能反應宿主免疫與病毒自身適應性的變化,而目LAM耐藥患者在Peg-IFN a-2a治療下耐藥毒株的動態(tài)變化和演變尚無報道。近年來,焦磷酸測序分析的方法越來越多的應用于生物醫(yī)學檢測。該方法由于高靈敏度、準確性以及高通量的特點,也逐漸被開發(fā)應用于HBV耐藥突變的檢測。本研究采用的基于焦磷酸測序設計的試劑盒,其可檢測10個常見HBV耐藥突變相關位點(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)。所以,首先我們對焦磷酸測序試劑盒進行了性能及臨床適用性的評價,隨后通過焦磷酸測序定量檢測Peg-IFN a-2a治療過程中LAM耐藥患者耐藥毒株的動態(tài)變化,并研究耐藥毒株的演變與治療療效的關系。研究對象與方法一、 標本來源1.焦磷酸測序試劑盒臨床驗證標本及標準品102例CHB患者臨床樣本選自2011年1月至2011年12月在南方醫(yī)院肝病中心住院或門診的病人。CHB診斷符合2005年慢性乙型病毒性肝炎防治指南相關標準；患者使用NA治療時間6個月；在治療期間發(fā)生病毒學突破(HBVDNA水平較最低點上升1個log值)或生化學突破,或經(jīng)過1年以上的抗病毒治療后HBV DNA仍然高于檢測下限(≥1000 copies/ml);在南方醫(yī)院肝病中心通過PCR聯(lián)合Sanger測序分析檢測HBV耐藥,成功獲得HBV RT區(qū)序列的患者。焦磷酸測序特異性檢測采用的是中國藥品生物制品檢定所提供的HBV核酸定量標準品中的陰性參考品。PCR最低檢測下限驗證采用世界衛(wèi)生組織HBVDNA定量標準品。含乙型肝炎病毒基因序列rt區(qū)片段、10個耐藥相關突變位點(rt169、rt173、 rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)均為野生型或突變型的質(zhì)粒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供。2.研究LAM耐藥毒株的演變及其與治療療效的關系的標本本研究中的所有患者均來自2005年至2008年進行的一項多中心、隨機、對照臨床試驗。此項臨床試驗在中國13個研究中心進行,其中包括香港。研究開始時共255例患者進入隨機分組,其中聚乙二醇干擾素a-2a治療組171例,阿德福韋治療組84例。根據(jù)其應答情況,本研究首先通過40例患者分析peg-IFN治療下耐藥毒株動態(tài)狀態(tài)及其與治療應答關系,其中13例患者發(fā)生完全應答,27例無應答患者通過年齡、性別、基線HBV DNA水平、基線HBsAg水平和HBV基因型與完全應答患者進行配對。而后,將所有24周血清量足夠的123例聚乙二醇干擾素a-2a治療患者用于驗證24周耐藥毒株定量與應答關系。二、 實驗技術1.核酸提取使用QIAamp UltraSens Virus Kit從200 μL血清樣本中提取40 μL核酸樣品,提取步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行,并在提取過程中采取必要措施防止樣本間的交叉污染。2.焦磷酸測序使用Qiagen公司提供的焦磷酸測序試劑盒可檢測10個常見HBV耐藥突變相關位點：rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250。擴增使用Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀,焦磷酸測序平臺為PyroMark(?) Q24 MDx (Qiagen,德國),測序步驟嚴格按照試劑盒的說明書進行。三、測序數(shù)據(jù)分析采用焦磷酸測序儀配套的分析軟件,首先進行單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析判定是否有突變。若該位點存在雜合突變,則進行突變株的比例分析,判斷突變病毒株在病毒準種中所占的比例,再通過后期線性關系計算出真實突變比例。四、焦磷酸試劑盒驗證1.PCR最低工作下限使用WHO乙型肝炎病毒核酸定量標準品梯度稀釋系列樣品驗證試劑盒PCR工作下限。2.線性范圍及準確性評價使用含乙型肝炎病毒基因序列rt區(qū)片段的10個耐藥相關突變位點均為野生型或均為突變型的2個質(zhì)粒樣品制備不同突變型/野生型比例的系列樣品,重復檢測至少10次用于評價試劑盒的準確性及建立突變比例真實值與檢測值的線性關系。3.焦磷酸測序與直接測序?qū)Ρ冗x取102例經(jīng)Sanger測序分析rt區(qū)序列的核苷(酸)類藥物治療慢性乙型肝炎患者臨床樣本,使用焦磷酸測序試劑盒檢測分析10個HBV耐藥相關突變位點的特征,評價兩種測序分析結果的一致性。五、臨床指標檢測方法1.血清HBV標志物的檢測使用商業(yè)化的試劑盒,檢測方法為Abbott Architect 12000免疫化學發(fā)光法。2.血清HBV DNA定量PCR熒光定量探針法,使用使用商業(yè)化的試劑盒Cobas Amplicor HBV Monitor V2.0檢測,檢測下限為60 IU/mL。3.ALT使用商業(yè)化的試劑盒,通過全自動生化檢測儀檢測,正常值上限為40U/L。六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計本文中所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以平均值±標準差或中位數(shù)(范圍)表示,率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率檢驗分析。定量資料用兩獨立樣本非參檢驗的Mann-Whitney U檢驗進行分析。陽性預測值、陰性預測值、特異性、敏感性和ROC曲線下面積用來檢驗預測因子預測預后的相應預測價值,線性關系評價采用線性擬合,所有結果均采用雙側(cè)檢驗,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果一、焦磷酸測序試劑盒驗證焦磷酸測序試劑盒的PCR工作下限為50 IU/mL；線性分析提示除rt236位點外,其他9個耐藥位點的突變比例真實值與檢測值線性關系均達到R20.98；臨床樣本檢測結果顯示,4例樣本部分位點PCR擴增失敗,98例樣本HBV DRT檢測結果與Sanger測序分析結果的總符合率達92.6%(897/969),其中10個耐藥相關突變位點結果全部一致的樣本占46.9%(46/98)；兩種測序方法在1 0個位點上的一致率介于71.5%至100%；兩種測序結果不一致中,87.5%(63/72)為Sanger測序結果為野生型(WT)而HBV DRT檢測結果為野生／突變混合型(WT/MT),6.9%(5/72)為Sanger測序結果為WT而HBV DRT檢測結果為MT,5.6%(4/72)為Sanger測序結果為WT/MT而HBV DRT檢測結果為WT。二、LAM耐藥毒株的演變及其與治療療效的關系1.焦磷酸測序結果共123例Peg-IFN a-2a治療組患者納入分析,首先40例用于分析拉米夫定耐藥動態(tài)變化的患者在0周、24周、48周、72周的焦磷酸測序成功率為100%(40/40)、82.5%(33/40)、70%(28/40)和87.5%(35/40)。隨后檢測了123例患者24周耐藥突變情況用于驗證其與療效關系,檢測成功率為91%(112/123)。2.患者基線臨床特征。共123例Peg-IFN a-2a治療組患者納入分析,其中101例為男性,22例為女性,中位年齡為33歲(19～63歲),血清HBV DNA水平為7.15±1.2 log IU/mL,ALT水平為72U/L (9～1776 U/L)。其中34例為基因B型,89例為基因C型。3.基線耐藥突變40例患者中M204V/I、L180M、A181V和V173L各位點上發(fā)生突變的人數(shù)占總?cè)藬?shù)百分比分別為100%(40/40)、82.5%(33/40)、60%(24/40)和10%(4/40),該四位點在患者體內(nèi)突變比率中位數(shù)分別為95.8%(29.6%-100%)、80.5%(0%-97.1%)、5.9%(0%-16.8%)和0%(0%-97%)。4. Peg-IFN a-2a治療下耐藥毒株變化情況rtM204V/I總突變百分率在完全應答組(CR)的0周、24周、48周和72周分別為91.3±19.4%、19.9±27.1%、9.1±26.4%和15.8±27.4%；無應答組(NR)的0周、24周、48周和72周分別為90±11.3%、47.2±32.2%、31.2±29.4%和21.3±29.9%。rtL180M突變百分率在CR組的0周、24周、48周和72周分別為50+44.6%、11.2±27.1%、13.6±23.9%和13.4±25.5%；NR組的0周、24周、48周和72周分別為69.4±32.4%、31.2±29.6%、11.66±29.7%和9.2±18.9.%。rtA181V突變百分率在CR組的0周、24周、48周和72周分別為5.8±5.9%、1.3±1.3%、1.0±2.1%和2.3±2.2%；NR組的0周、24周、48周和72周分別為6.0±5.2%、4.6±2.8%、4.5±3.7%和5.3±3.2%。5.基線耐藥毒株突變百分率與治療療效關系基線rtM204V/I平均突變比率在CR組和NR組無顯著統(tǒng)計學差異(91.3±19.4% vs 90±11.3%,P=0.132)�；�rtLl 80M平均突變比率在CR組和NR組無顯著統(tǒng)計學差異(50+44.6%vs 69.4±32.4%P=0.307)�；�rtA181V平均突變比率在CR組和NR組無顯著統(tǒng)計學差異(5.8-±-5.9%vs4.6±2.8%P=0.311)。6.24周耐藥毒株突變比率與Peg-IFN治療應答的關系24周M204V/I、L180M和A181V等位點在CR組和NR組之間均有統(tǒng)計學差異(P均0.01)。40例患者24周時HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V對于治療應答的預測的ROC曲線下面積分別為0.866、0.872、0.771、0.781和0.862。全部123例患者的24周時HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V對于治療應答的預測的ROC曲線下面積分別為0.809、0.833、0.672、0.759和0.764。7.24周預測完全應答的最佳cut-off值HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V在24周預測完全應答的最佳cut-off值分別為6 log IU/mL、 2log IU/mL、20%、5%和5%。結論1.焦磷酸試劑盒用于檢測乙肝耐藥基因具有良好的敏感性和準確性,在檢測樣本中存在少量病毒突變株時優(yōu)于直接測序,可用于耐藥突變的早期檢測。2.基于本研究數(shù)據(jù),我們并未發(fā)現(xiàn)基線病毒耐藥毒株突變百分率與治療療效的關系,基線時完全應答組和無應答組在M204V/I、L180M、A181V等三位點的耐藥毒株突變百分率無統(tǒng)計學差異,基線病毒耐藥毒株突變百分率并不能預測治療應答。3.24周耐藥毒株突變比率水平的高低可預測Peg-IFN治療拉米夫定耐藥患者的療效,在全部123例患者M204V/I、L180M和A1 81V對于治療應答的預測的ROC曲線下面積分別為0.672、0.759和0.764。但預測作用最強的仍是HBV DNA和HBsAg水平。4.24周時,耐藥毒株突變比率水平結合HBV DNA和HBsAg水平可增強預測效能,當HBV DNA6 log10 IU/mL, HBsAg2 log10 IU/mL且rtA1 81V5%時,其預測敏感度為84.62%,特異度為81.48%,陽性預測值(PPV)為68.75%,陰性預測值(NPV)為91.67%。提示在使用聚乙二醇干擾素對拉米夫定耐藥進行挽救治療可定量檢測突變水平來增加預測效能。
【關鍵詞】：慢性乙型肝炎 焦磷酸測序 拉米夫定耐藥 聚乙二醇干擾素 YMDD突變
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 第一章 研究背景22-31
• 第一節(jié) 乙肝與耐藥22-23
• 第二節(jié) HBV耐藥突變定義及機制23-25
• 第三節(jié) HBV突變檢測方法25-27
• 第四節(jié) 焦磷酸測序27-28
• 第五節(jié) 拉米夫定耐藥挽救治療28-29
• 第六節(jié) 聚乙二醇干擾素用于核苷類藥物耐藥挽救治療29-31
• 第二章 焦磷酸測序試劑盒性能評價及臨床適用性31-46
• 第一節(jié) 材料和方法31-39
• 1.1 研究對象31-32
• 1.2 標準品來源32
• 1.3 試劑與儀器32-33
• 1.4 核酸提取33-34
• 1.5 焦磷酸測序34-38
• 1.6 臨床樣本耐藥檢測38
• 1.7 統(tǒng)計分析38-39
• 第二節(jié) 結果39-43
• 1.1 HBV DRT試劑盒性能評價39-41
• 1.2 臨床樣本結果41-43
• 第三節(jié) 討論43-46
• 第三章 Peg-IFN α-2a治療LAM耐藥HBeAg陽性CHB中耐藥突變毒株變化及其與療效的關系46-64
• 第一節(jié) 材料和方法47-50
• 1. 標本來源和研究設計47-49
• 2. 血清HBV DNA的抽提49
• 3. 焦磷酸測序49
• 4. 臨床指標49-50
• 5. 統(tǒng)計分析50
• 第二節(jié) 研究結果50-61
• 1. 患者基線臨床特征50-51
• 2. 焦磷酸測序結果51
• 3. 基線耐藥突變51-53
• 4. Peg-IFN α-2a治療下耐藥毒株變化情況53-56
• 5. rtL180M與rtM204V相關性分析56-58
• 6. 耐藥毒株突變動態(tài)變化與治療療效關系58-61
• 第三節(jié) 討論61-64
• 參考文獻64-69
• 中英文縮略詞對照表69-70
• 攻讀碩士學位期間撰寫的論文70-71
• 致謝71-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉玲;李從榮;鄭毅;趙友云;;巢式PCR聯(lián)合焦磷酸測序檢測乙肝病毒耐藥基因的方法建立和初步臨床應用[J];中西醫(yī)結合肝病雜志;2013年03期

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本文編號：671265