本文關(guān)鍵詞：發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白、核蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS),是一種新發(fā)出血熱性傳染病,由一種新的布尼亞病毒,簡稱SFTSV引起。SFTS每年的發(fā)病率大約是每10萬農(nóng)村人口中有5人發(fā)病,主要感染中老年人,病死率平均是12%。自2009年在中國發(fā)現(xiàn)以來,SFTSV已在韓國和日本報(bào)道,相似病毒在美國報(bào)道。SFTSV是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒,包含L、M、S三個(gè)片段,分別編碼RNA聚合酶、糖蛋白(Gn、Gc)前體、核蛋白NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。其中Gn、Gc最可能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生,目前已有研究發(fā)現(xiàn)能結(jié)合M片段的單克隆抗體(MAb4-5)可以中和SFTSV;而S片段最為保守,NP最易表達(dá),常被用來做免疫檢測用。本研究旨在構(gòu)建NP、Gn、Gc及M片段分段蛋白的真核表達(dá)載體,表達(dá)相應(yīng)蛋白,從抗原性和免疫原性方面檢測NP的生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究中和抗體做好鋪墊。目的1、構(gòu)建核蛋白NP,糖蛋白Gn、Gc真核表達(dá)載體。2、構(gòu)建M片段(編碼糖蛋白)分段真核表達(dá)載體。3、表達(dá)核蛋白,研究重組核蛋白NP的生物學(xué)活性。方法1、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增NP、Gn和Gc。2、設(shè)計(jì)引物分20段擴(kuò)增M片段(M1-M20),每段重疊30個(gè)堿基。3、設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增NP、Gn和M1,建立與GFP的融合蛋白序列,監(jiān)測蛋白表達(dá)情況。3、將目的基因與克隆載體19T(Simple)連接擴(kuò)增后,再與表達(dá)載體pVAX1連接。4、將目的基因-pVAX1構(gòu)建的表達(dá)載體用陽性脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至Vero細(xì)胞,在Vero細(xì)胞內(nèi)表達(dá),用Western blot、間接免疫熒光、顯微鏡觀察融合蛋白熒光的方法檢測蛋白表達(dá),用鎳柱純化帶His標(biāo)簽的NP。5、包被純化的NP,包被板與商品化試劑盒同時(shí)檢測羊血清中SFTSV抗體,比較檢測的效果。6、用純化的NP免疫BALB/c小鼠,測定血清滴度。結(jié)果1、構(gòu)建出核蛋白NP,糖蛋白Gn、Gc, M片段分段蛋白的真核表達(dá)載體,構(gòu)建出NP、Gn、Gc、M1分別和GFP的融合蛋白表達(dá)載體,測序正確。檢測到上述蛋白在Vero細(xì)胞中的表達(dá)。2、用NP自行包被的包被板與商品化的試劑盒在檢測羊血清陽性率的效果上,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3、用NP免疫BALB/c小鼠獲得有效陽性血清。結(jié)論1、構(gòu)建的pVAX1真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后可表達(dá)NP、Gn、Gc及M片段的分段蛋白,但M片段編碼的蛋白表達(dá)量較低。2、用pVAX1構(gòu)建的表達(dá)載體在Vero細(xì)胞中表達(dá)出的NP在ELISA和免疫動(dòng)物方面具有良好的生物學(xué)活性。
【關(guān)鍵詞】：發(fā)熱伴血小板減少綜合征 布尼亞病毒 糖蛋白 核蛋白 真核表達(dá) 生物學(xué)活性
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.8
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符號(hào)說明11-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 材料與方法16-49
• 2.1 材料16-28
• 2.2 方法28-49
• 第三章 結(jié)果49-61
• 3.1 目的基因的擴(kuò)增49-50
• 3.2 含目的基因的克隆載體和真核表達(dá)載體的構(gòu)建及序列分析50-52
• 3.3 重組蛋白的表達(dá)和鑒定52-57
• 3.4 重組蛋白NP表達(dá)產(chǎn)物的純化57-58
• 3.5 重組蛋白NP在ELISA應(yīng)用中的研究58-60
• 3.6 重組蛋白NP的免疫原性研究60-61
• 第四章 討論61-64
• 第五章 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文70-71
• 附件71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 盧靜;李川;張福順;蕪為;張全福;張黎;王濤;王芹;仇佩虹;梁米芳;李德新;;發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)研究[J];病毒學(xué)報(bào);2011年06期

2 遲媛媛;翟慎勇;溫紅玲;崔峰;宋艷艷;王玲;杜俊;曹海霞;王謙;張壽鋒;于學(xué)杰;趙麗;;發(fā)熱伴血小板減少綜合征患者血清中新型布尼亞病毒RNA的檢測[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年11期

3 揭盛華;周艷;孫立平;梁凱威;易小玲;李慧玉;;Close Correlation between Development of MODS during the Initial 72h of Hospitalization and Hospital Mortality in Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮岑;SFTSV全基因組序列及其核衣殼蛋白的原核表達(dá)分析[D];浙江師范大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：498148