發(fā)布時間：2017-06-02 12:26

  本文關鍵詞：漢防己甲素對伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉增效活性及其主要機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討漢防己甲素(tetrandrine,TET)對伊曲康唑(itraconazole,ITR)和伏立康唑(voriconazole,VRC)抗煙曲霉有無增效活性及其主要增效機制。方法參照M38-A方案的微量稀釋法,以23株煙曲霉臨床株為研究對象,測定TET對其的最大非細胞毒性劑量和ITR、VRC單獨及聯合TET對其的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MICs);參照M38-A2方案的棋盤微量稀釋法,測定ITR或VRC單獨及聯合TET抗23株煙曲霉臨床株活性,結合FICI(fractional inhibitory concentration index)法和ΔE法對其結果進行評價;用時間-殺菌曲線法動態(tài)觀察TET對ITR或VRC體外抗敏感株AF17和耐藥株AF23活性。以煙曲霉構建小鼠系統感染模型,ITR或VRC單獨及聯合TET治療后,從生存率和病原學判斷其作用效果;用R6G外排法和RT-PCR法分別測定外排泵功能及其相關基因MDR1、MDR2、MDR3、MDR4和ATRF于ITR或VRC單獨及聯合TET作用后的相對表達量。結果TET抗煙曲霉的最大非細胞毒性劑量為80μg/m L。ITR單獨及聯合TET對煙曲霉的MIC值范圍分別為0.5μg/m L~32μg/m L和0.0625μg/m L~4μg/m L,差異有統計學意義(P0.05);VRC單獨及聯合TET的MIC值范圍分別為0.25μg/m L~2μg/m L和0.03125μg/m L~0.25μg/m L,差異有統計學意義(P0.05);ITR聯合TET作用時,ITR的MIC值由0.125~32μg/m L降至0.0625~2μg/m L,TET的MIC值由256~512μg/m L降至8~64μg/m L,FICI和ΔE法評價均表現為協同作用;VRC聯合TET作用時,VRC的MIC值由0.125~2μg/m L降至0.03~0.5μg/m L,TET的MIC值由256~512μg/m L降至8~256μg/m L,FICI和ΔE法評價17株菌表現為協同作用,6株菌表現為無關作用;時間殺菌曲線示:不同濃度的ITR或VRC聯合TET比其單獨作用均降低煙曲霉的細胞活性,并且縮短抑菌作用的時間。ITR或VRC聯合TET比其單獨作用均可提高小鼠的生存率(P0.05)和降低腎、腦負荷的煙曲霉菌量(P0.05)。TET可減少煙曲霉對R6G的外排;ITR或VRC聯合TET比其單獨作用的外排泵基因MDR2、MDR3、MDR4和ATRF低表達(P0.05)。結論漢防己甲素在體外及小鼠體內對伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉有增效活性;其增效活性與其抑制藥物外排功能有關,可能與下調外排泵基因MDR2、MDR3、MDR4和ATRF的表達有關。
【關鍵詞】：漢防己甲素 伊曲康唑 伏立康唑 煙曲霉 增效作用 機制
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R756
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 前言11-20
• 1 煙曲霉感染的流行病學現狀11-12
• 2 臨床煙曲霉感染的治療現狀12
• 3 煙曲霉對唑類藥物耐藥機制12-14
• 4 應對唑類抗真菌藥物耐藥所采取的策略和分析14-16
• 5 漢防己甲素概況及其作為唑類藥物增效劑的研究進展16-18
• 6 本研究的內容、創(chuàng)新性及意義18-20
• 第一部分 漢防己甲素對伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉體外增效活性研究20-42
• （一）以微量稀釋法測定最大非細胞毒性劑量漢防己甲素對伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉活性20-25
• 1 材料20-21
• 1.1 菌株20
• 1.2 藥物20
• 1.3 主要試劑20-21
• 1.4 實驗儀器與設備21
• 1.5 藥物與主要試劑的配制21
• 2 方法21-22
• 2.1 菌株的保存與活化21-22
• 2.2 菌懸液制備22
• 2.3 TET對23株煙曲霉孢子相的最大非細胞毒性劑量測定22
• 2.4 ITR或VRC單獨及聯合最大非細胞毒性劑量的 TET 抗煙曲霉活性測定22
• 2.5 統計學分析22
• 3 結果22-25
• 3.1 質控標準22
• 3.2 TET對煙曲霉的非細胞毒性劑量22-23
• 3.3 ITR或VRC單獨及聯合TET抗煙曲霉活性23-25
• （二）以棋盤式微量液基稀釋法測定并評價漢防己甲素與伊曲康唑和伏立康唑的體外靜態(tài)聯合抗煙曲霉作用25-33
• 1 材料25-26
• 1.1 菌株25
• 1.2 藥物25
• 1.3 主要試劑25
• 1.4 實驗儀器與設備25-26
• 1.5 藥物與主要試劑的配制26
• 2 方法26-28
• 2.1 菌株的保存與活化26
• 2.2 菌懸液配制26-27
• 2.3 用棋盤法測定TET聯合ITR或VRC抗煙曲霉活性27
• 2.4 藥物聯合作用效果的評價 采用FICI法和ΔE法對棋盤式微量液基稀釋法27-28
• 3 結果28-33
• 3.1 質控標準28
• 3.2 棋盤法測定藥物對煙曲霉的活性28
• 3.3 藥物聯合作用效果的評價28-33
• （三）以時間-殺菌曲線法測定并評價漢防己甲素與伊曲康唑和伏立康唑的體外動態(tài)聯合抗煙曲霉作用33-42
• 1 材料33-34
• 1.1 菌株33
• 1.2 藥物33
• 1.3 主要試劑33
• 1.4 實驗儀器與設備33-34
• 1.5 藥物與主要試劑的配制34
• 2 方法34-35
• 2.1 菌株的保存與活化34
• 2.2 菌懸液制備34-35
• 2.3 時間-殺菌作用體系的制備35
• 2.4 時間-殺菌作用體系的測定35
• 3 結果35-39
• 4 討論39-41
• 5 小結41-42
• 第二部分 漢防己甲素對伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉體內增效活性研究42-50
• 1 材料42-43
• 1.1 菌株42
• 1.2 藥物42
• 1.3 主要試劑42
• 1.4 實驗儀器與設備42-43
• 1.5 藥物與主要試劑的配制43
• 2 方法43-44
• 2.1 菌株的保存與活化43
• 2.2 菌懸液配制43
• 2.3 小鼠43
• 2.4 小鼠免疫抑制與系統造模43
• 2.5 分組及給藥43-44
• 2.6 療效評價44
• 3 結果44-48
• 3.1 小鼠生存率44-46
• 3.2 病原學檢查46-48
• 4 討論48-49
• 5 小結49-50
• 第三部分 漢防己甲素對伊曲康唑和伏立康唑抗煙曲霉增效活性機制研究50-66
• （一）采用R6G外排法測定TET對煙曲霉外排泵功能影響50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 菌株50
• 1.2 藥物50
• 1.3 主要試劑50
• 1.4 實驗儀器與設備50-51
• 1.5 藥物與主要試劑的配制51
• 2 方法51-53
• 2.1 菌株的保存與活化51
• 2.2 菌懸液配制51-52
• 2.3 羅丹明 6G (R6G) 標準曲線的確立52
• 2.4 煙曲霉細胞對R6G的吸收和外排52-53
• 3 結果53-57
• 3.1 R6G標準曲線的建立53
• 3.2 煙曲霉對R6G的吸收53-54
• 3.3 煙曲霉對R6G的外排54-57
• （二）采用RT-PCR法測定外排泵相關基因藥物作用前后的相對表達量57-66
• 1 材料57-58
• 1.1 菌株57
• 1.2 藥物57
• 1.3 主要試劑57
• 1.4 實驗儀器與設備57-58
• 1.5 藥物與主要試劑的配制58
• 2 方法58-62
• 2.1 菌株的保存與活化58
• 2.2 菌懸液配制58
• 2.3 藥物處理菌液58-59
• 2.4 菌體RNA提取59
• 2.5 樣品RNA純化59-60
• 2.6 樣品RNA質量鑒定60
• 2.7 RNA逆轉錄合成cDNA60
• 2.8 實時熒光PCR60-61
• 2.9 統計學分析61-62
• 3 結果62-64
• 3.1 外排泵基因的m RNA水平的相對表達量62
• 3.2 藥物作用后外排泵基因m RNA水平相對表達量62-64
• 4 討論64-65
• 5 小結65-66
• 結論66-68
• 縮略詞表68-69
• 參考文獻69-80
• 附錄80-82
• 致謝82

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